植物-微生物相互作用:丝状芽孢杆菌对马铃薯根系分泌物的转录反应
Summary
本议定书的目的是研究 endosphere 分离芽孢杆菌丝状对马铃薯根系分泌物的 transcriptomic 反应。这种方法有助于鉴定与植物微生物相互作用有关的重要细菌基因, 并原则上适用于其他菌和植物, 并作小的调整。
Abstract
有益植物相关的细菌在促进植物生长和预防疾病中起着重要作用。应用植物生长促进细菌 (PGPR) 作为生物肥料或生防剂已成为使用常规肥料的有效替代品, 并能以较低的成本提高作物生产率。植物-微生物的相互作用取决于寄主植物分泌的信号以及它们伴生细菌的反应。然而, 分子机制的有益细菌如何响应其相关的植物衍生信号是没有充分了解。评估细菌对根分泌物的 transcriptomic 反应是确定际条件下细菌基因表达和调控的有力途径。这种知识对于了解植物-微生物相互作用所涉及的基本机制是必要的。本文描述了一个详细的协议, 以研究丝状EC18 的 transcriptomic 反应, 从马铃薯 endosphere 的菌株, 马铃薯根系分泌物。在最近的高通量测序技术的帮助下, 该协议可以在几个星期内执行, 并产生大量的数据集。首先, 我们收集在不育条件下的根分泌物, 然后将它们添加到B. 丝状文化中。这些文化中的 RNA 是用苯酚/氯仿方法与商业试剂盒相结合, 并通过自动电泳仪器进行质量控制而分离出来的。在测序后, 采用基于 web 的 T 型雷克斯管道进行数据分析, 确定了一组差异表达基因。这种方法是一个有用的工具, 以促进新发现的细菌基因所涉及的植物-微生物相互作用。
Introduction
植物可能渗出多达20% 的碳固定在光合作用中通过根进入根际1,即, 土壤狭窄的区域附近的根。由于养分的可用性较高, 根际是一种适合多种微生物的栖息地, 包括植物生长促进细菌。根分泌物含有一系列无机化合物, 如离子、无机酸、氧和水。然而, 大多数根系分泌物是由有机物质形成的, 可分为低分子量化合物和高分子量化合物。低分子量化合物包括氨基酸, 有机酸, 糖, 酚类化合物, 脂肪酸, 和一系列次生代谢物。高分子量化合物包括粘液和蛋白质2,3。根际微生物可以将其中一些化合物用作生长和发育的能量来源。根系分泌物在 rhizobacterial 群落的形成过程中起着重要的作用, 因为植物产生的化合物能通过影响特异基因的表达影响根际相关细菌的行为。
了解细菌对根分泌物的反应是破译植物-微生物相互作用机制的关键步骤。由于细菌对植物-微生物相互作用的反应是差异基因表达的产物, 可以通过转录分析来研究。使用这种方法, 以前的研究发现了几个重要的基因参与植物-微生物的相互作用。在铜绿假单胞菌中, 参与代谢、趋化和 II. 型分泌的基因对甜菜根分泌物4有反应。风扇等。5研究了amyloliquefaciens FZB42 对玉米根系分泌物的 transcriptomic 分析。结果表明, 在根分泌物强烈诱发的基因中, 有几个组参与了与养分利用、趋化、运动和非核糖体合成抗菌肽和 polyketides 有关的代谢途径。
这些研究的准确性依赖于根系分泌物的收集。虽然有几种方法描述了用于不同目的的根分泌物的收集, 但它们要么要求尖端仪器, 要么在受控条件6、7、8中不执行。此外, 根际抑制微生物可以影响植物细胞膜通透性和损害根组织, 特别是在微生物联合体9的情况下, 对根分泌物的组成有很显著的作用。在调查微生物对根分泌物的反应时, 重要的是使用明确的条件, 以避免其他微生物对化合物的改变10。此外, 基于 rna 序列的转录研究需要高质量的 rna。然而, 当处理非模型细菌菌株时, 标准协议或商业套件通常由于未知因素或特殊生长特性而效率低下。
这里描述的协议是使用丝状, 这是一个革兰阳性, 孢子形成细菌的 Firmicute。它在各种植物的根际中普遍存在。本文报道了几种植物生长促进特性, 包括甜菜11的系统抗性 (ISR) 的诱导, 对黄瓜12的禾草病原菌的抑制作用, 以及氮固定在向日葵根际13。然而, 其与寄主植物相互作用的分子机制还没有得到很好的研究。
本文的实验目的是研究 endosphere 分离的丝状对马铃薯根系分泌物的 transcriptomic 反应。简而言之, 该议定书由以下步骤组成: 一是在无菌条件下收集马铃薯根系分泌物。然后, 从细菌细胞中提取高质量的 RNA, 用根分泌物处理。最后一步是使用基于 web 的 T 雷克斯管道14的数据分析。该协议用于识别丝状基因, 表明在接触到根系分泌物时表达水平的变化, 从而可能在植物微生物相互作用中发挥重要作用。
Protocol
Representative Results
Discussion
植物-微生物相互作用被假设是由一个微妙地调整的平衡在细菌和植物之间决定。这种相互作用是高度复杂和难以研究的自然系统, 其中包括多种微生物物种, 可能作为联营集团。本文介绍了一种简化的协议, 以研究在良好的控制条件下, 根分泌物的细菌反应。在暴露于根分泌物时, 细菌的转录剖面提供了细菌对根际生态位的适应的详细信息。这种根分泌物收集协议不需要复杂的程序和专用设备。然?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢雅各布维尔为他提供了有益的意见和建议。我们还感谢安妮在生物信息学分析方面的帮助。Yanglei 和智博李得到中国奖学金委员会 (CSC) 的支持。我们感谢 NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) 对 OPK 的财政支持。
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
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