Bitki-mikrop etkileşim: Transkripsiyon yanıt Bacillus Mycoides patates kök Exudates için
Summary
Burada sunulan Protokolü amacı endosphere izole Bacillus mycoides transcriptomic yanıt patates kök exudates için incelemektir. Bu yöntem önemli bakteriyel genler bitki-mikrop etkileşimlerde yer tanımlamasını kolaylaştırır ve prensip olarak diğer endophytes ve bitkilerle küçük ayarlamalar için geçerli olduğunu.
Abstract
Yararlı bitki ilişkili bakterilerin büyüme teşvik ve bitkilerde hastalık önleme önemli bir rol oynamaktadır. Bitki büyüme teşvik rhizobacteria (PGPR) uygulama biofertilizers veya biyolojik ajanlar olarak geleneksel gübre kullanımı için etkili bir alternatif haline gelmiştir ve düşük maliyetle ürün verimliliği artırabilir. Bitki-mikrop etkileşimler ana bitki salgılanan sinyalleri ve onların ilişkili bakteriler tarafından bu andan bir tepki bağlıdır. Ancak, nasıl yararlı bakteriler moleküler mekanizmaları için bunların ilişkili bitki kaynaklı sinyalleri tam olarak anlaşılamamıştır yanıt. Kök exudates bakteri transcriptomic yanıtı değerlendirirken bakteri gen ekspresyonu ve yönetmelik rhizospheric koşullar altında belirlemek için güçlü bir yaklaşımdır. Böyle bir bilgiye temel mekanizmaları bitki-mikrop etkileşimleri dahil anlamak gereklidir. Bu kağıt B. mycoides EC18, patates endosphere patates kök exudates için izole bir yük transcriptomic yanıt çalışmaya detaylı bir protokolünü açıklar. Son yüksek üretilen iş sıralama teknolojisi sayesinde, bu iletişim kuralı birkaç hafta ve üretmek büyük veri kümeleri olarak gerçekleştirilebilir. İlk olarak, kök exudates sonra bunlar B. mycoides kültürler için eklenir steril koşullarda topluyoruz. Bu kültürlerden RNA ticari bir kit ile kombine ve kalite kontrol için otomatik Elektroforez enstrüman tarafından tabi fenol/kloroform yöntemini kullanarak ayrı tutulur. Sonra sıralama, veri analizi T-REx örümcek ağı-esaslı boru hattı ile gerçekleştirilir ve bir grup differentially ifade genlerin tanımlanır. Bu yöntem bakteriyel genler bitki-mikrop etkileşimlerde yer üzerinde yeni keşifler kolaylaştırmak için yararlı bir araçtır.
Introduction
Bitkiler fotosentez kökleri aracılığıyla sırasında sabit rizosferde1, yani, toprak kökleri yakınındaki dar bölge içine karbon % 20’e kadar çıktı olabilir. Daha yüksek besin durumu nedeniyle, rizosferde bitki büyüme teşvik bakteriler de dahil olmak üzere çeşitli mikroorganizmalar için uygun bir yaşam alanı olduğunu. Kök exudates inorganik bileşikler iyonları, İnorganik asitler, oksijen ve su gibi bir dizi içerir. Ancak, kök exudates çoğunluğu düşük moleküler ağırlıklı bileşikler ve yüksek moleküler ağırlıklı bileşikler ayrılabilir organik maddeler tarafından oluşturulur. Düşük moleküler ağırlıklı bileşikler amino asitleri, organik asitler, şekerler, fenolik bileşikler, yağ asitleri ve sekonder metabolitler bir dizi içerir. Yüksek molekül ağırlıklı bileşikler zamk ve proteinler2,3/ oluşur. Rizosferde mikroorganizmaların bu bileşiklerin bazıları büyüme ve gelişme için bir enerji kaynağı olarak kullanabilirsiniz. Kök exudates exudates bitki üretilen bileşikler belirli genlerin ifade etkileyen bakteriler rizosferde ilişkili davranışını etkileyebilir beri rhizobacterial topluluk şekillenmesinde önemli bir rol oynamaktadır.
Bakteriyel yanıt-e doğru kök exudates anlama bitki-mikrop etkileşim mekanizmaları deşifre önemli bir adımdır. Bakteriyel yanıt-e doğru bitki-mikrop etkileşimleri farklı gen ekspresyonu ürün olduğu için transcriptome analizi ile okudu olabilir. Bu yöntemi kullanarak, önceki çalışmalarda birkaç önemli genler bitki-mikrop etkileşimlerde yer tespit edilmiştir. Pseudomonas aeruginosaiçinde genlerin metabolizma, kemotaksis ve tip II salgı şeker pancarı kök exudates4‘ e cevap gösterilmiştir. Fan ve ark. 5 yanıt olarak Mısır kök exudates B. amyloliquefaciens FZB42 transcriptomic profilleme okudu. Güçlü kök exudates tarafından indüklenen genler, çeşitli gruplar metabolik yollar besin kullanımı, kemotaksis, hareketliliği ve ribozomal sigara Sentezi antimikrobiyal peptidler ve polyketides ilgili söz konusu olduğunu, bunların sonuçları göster.
Bu çalışmalar doğruluğunu kök exudates koleksiyon üzerinde dayanır. Her ne kadar çeşitli yöntemler farklı amaçlar için kök exudates topluluğu tarif var, sofistike aletleri talep ya da iyi denetlenen koşullar6,7,8‘ gerçekleştirilmez. Ayrıca, rizosferde inhibe mikroorganizmalar bitki hücre membran geçirgenliği etkileyen kök çıktı kompozisyon etkileyebilir ve konsorsiyumlar mikroorganizmaların9durumunda özellikle kök dokulara zarar. Kök exudates mikrobiyal cevaben araştırıyor tarafından diğer mikroorganizmalar10bileşikleri değiştirilmesini önlemek için iyi tanımlanmış koşulları kullanmak önemlidir. Ayrıca, RNA-seq tabanlı transcriptome çalışmaları için yüksek kaliteli RNA gereklidir. Ancak, modeli bakteri suşları ile uğraşırken, standart protokolleri veya ticari kitleri genellikle düşük verimlilik bilinmeyen faktörler veya özel büyüme özellikleri nedeniyle var.
Burada açıklanan protokol Firmicute şube bir gram-pozitif, spor oluşturan bakteri olan B. mycoides,’ı kullanarak doğrulandı. Çeşitli bitki türlerinin rizosferde içinde her yerde. Şeker pancarı11, sönümleme-off patojen Pythium salatalık12yanı sıra azot inhibisyonu indüksiyon sistematik direnç (ISR) dahil olmak üzere bu tür için birkaç bitki büyüme teşvik özellikleri bildirilmiştir Ayçiçeği rizosferde13fiksasyonu. Ancak, bir ana bitki ile etkileşimi moleküler mekanizmaları iyi okudu değil.
Burada sunulan deneyler amacı endosphere izole B. mycoides transcriptomic yanıt patates kök exudates için incelemektir. Kısacası, protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: Birincisi, patates kök exudates Steril koşullar altında toplamak. Sonra yüksek kaliteli RNA bakteri hücreleri kök exudates ile tedavi ayıklamak. Son adım, web tabanlı T-REx boru hattı14kullanarak veri analizidir. Bu iletişim kuralı ifade düzeylerinde kök-exudates ile temas üzerine bir kayma göstermek ve böylece bitki-mikrop etkileşimlerde önemli bir rol oynayabileceği B. mycoides genlerin tanımlamak için kullanıldı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bitki-mikrop etkileşimleri bakteri ve bitkiler arasındaki ince ayarlı bir denge tarafından belirlenecek olan. Bu tür etkileşimler son derece karmaşık ve zor çalışma için doğal bir sistemde, hangi oluşur çeşitli mikrobiyal türler, potansiyel olarak konsorsiyum hareket. Bu kağıt bakteriyel yanıt-e doğru kök exudates iyi kontrollü şartlar altında çalışmak için basitleştirilmiş bir protokolünü açıklar. Rhizobacteria, kök exudates, maruz kalma üzerine transcriptome profil bakteriyel uyum r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jakob Viel onun yararlı yorumlar ve öneriler için teşekkür ederiz. Biz de Anne de Jong Biyoinformatik Analizi onun yardım için teşekkür ederim. Yanglei Yi ve Zhibo Li Çin burs Konseyi (CSC) tarafından desteklenir. NWO-TTW Perspectief başına Programma Back2Roots teşekkür ediyoruz (TKI-AF-15510) OPK için finansal destek için.
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
- Haichar, F. e. Z., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -. H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
