Завод микробных взаимодействий: Транскрипционный анализ ответ Bacillus Mycoides картофель корень экссудаты
Summary
Цель Протокола, представленные здесь является изучение реакции транскриптомики endosphere изолированные Bacillus mycoides картофель корень экссудата. Этот метод способствует выявлению важных бактериальных генов, участвующих в завод микробных взаимодействий и в принципе применима к другим эндофитов и растений, с незначительными изменениями.
Abstract
Полезные бактерии завод связанные играют важную роль в поощрении роста и предотвращения болезней растений. Применение rhizobacteria роста растений (PGPR) как Биоудобрения или биоконтроля агентов стал эффективной альтернативой использования обычных удобрений и может увеличить урожайность при низких затратах. Завод микробных взаимодействий зависит от хоста выделяется завод сигналов и реакцией расписка их связанные бактерий. Однако молекулярные механизмы как полезных бактерий реагировать их связанного растительного сигналы полностью не поняты. Оценка транскриптомики реакции бактерий на корень экссудата является мощный подход для определения экспрессии генов бактерий и регулирование rhizospheric условиях. Такие знания необходимо понимать основные механизмы, участвующие в завод микробных взаимодействий. Этот документ описывает подробный протокол для изучения реакции транскриптомики B. mycoides EC18, штамм, изолированные друг от друга от endosphere картофеля, картофель корень экссудата. С помощью последних технологий высокопроизводительного секвенирования этот протокол может выполняться в нескольких недель и производить массовых наборов данных. Во-первых мы собираем корень экссудата в стерильных условиях, после чего они добавляются в б. mycoides культур. RNA от этих культур изолированы с помощью метода фенол/хлороформ в сочетании с комплектом коммерческих и подвергли контроля качества инструмент автоматизированного электрофореза. После виртуализации, проводится анализ данных с помощью веб T-REx конвейера и определены группы дифференциально выраженной генов. Этот метод является полезным инструментом для содействия новым открытиям на бактериальных генов, участвующих в завод микробных взаимодействий.
Introduction
Растения могут экссудата до 20% углерода, зафиксированной во время фотосинтеза через корни в ризосфере1, т.е., узкая зона почвы возле корней. Из-за более высокую доступность питательных веществ ризосфере является подходящую среду обитания для различных микроорганизмов, включая поощрение роста растений бактерии. Экссудат корня содержат широкий спектр неорганических соединений как ионы, неорганических кислот, кислорода и воды. Однако большинство из корня экссудата формируется органических материалов, которые могут быть разделены низкомолекулярных соединений и высокомолекулярных соединений. Низкомолекулярных соединений относятся аминокислоты, органические кислоты, сахара, фенольные соединения, жирные кислоты и массив вторичных метаболитов. Высокомолекулярные соединения состоят из белков и слизь2,3. Ризосфере микроорганизмов можно использовать некоторые из этих соединений как источника энергии для экономического роста и развития. Корень экссудата играют важную роль в формировании rhizobacterial сообщества, поскольку завод выпускал соединений в экссудата может повлиять на поведение связанных ризосферной бактерии, затрагивая экспрессии определенных генов.
Понимание бактериальных ответ на корень экссудата является ключевым шагом в расшифровке механизмы взаимодействия растений микроба. Как бактериальный ответ на завод микробных взаимодействий является продуктом экспрессии генов дифференциальных, могут изучаться с транскриптом анализа. С помощью этого метода, предыдущие исследования определили ряд важных генов, участвующих в завод микробных взаимодействий. В Pseudomonas aeruginosaгенов, участвующих в метаболизме, хемотаксис и тип II секрецию показывали реагировать сахарная свекла корень экссудата4. Вентилятор и др. 5 изучал транскриптомики профилирование б. amyloliquefaciens FZB42 в ответ на кукурузный корневой экссудата. Их результаты показывают, что, генов, сильно индуцированных корень экссудата, несколько групп участвуют в метаболических путях, касающиеся утилизации питательных веществ, хемотаксис, моторики и не рибосомной синтеза антимикробных пептидов и поликетиды.
Точность этих исследований зависит от коллекции корневых экссудата. Хотя несколько методов описал коллекцию корневых экссудат для различных целей, они требуют сложных инструментов или не выполняются в строго контролируемых условиях6,,7,8. Кроме того, ингибирующих ризосфере микроорганизмов могут влиять корень экссудата состав, влияя на завод проницаемости клеточных мембран и повреждения тканей корня, особенно в случае консорциумов микроорганизмов9. При расследовании микробной ответ на корень экссудаты, важно использовать четко определенных условиях для того, чтобы избежать изменения соединений от других микроорганизмов10. Кроме того высокое качество РНК требуется для РНК seq транскриптом исследования. Однако при работе с не модель бактериальных штаммов, стандартные протоколы или коммерческих комплекты обычно имеют низкую эффективность из-за неизвестных факторов или специальных роста свойства.
Протокол, описанные здесь была проверена с помощью б. mycoides, который является грамположительных, спорообразующих бактерий Фила Firmicute. Это повсеместно в ризосфере различных видов растений. Несколько свойств поощрение роста растений были зарегистрированы для этого вида, в том числе индукции систематического сопротивления (ISR) в сахарной свеклы11, ингибирование затухания от возбудителя Pythium огурец12, а также азота Фиксация в ризосфере подсолнечника13. Однако молекулярные механизмы взаимодействия с растения-хозяина не хорошо изучены.
Цель экспериментов, представленные здесь является изучение реакции транскриптомики изолированные endosphere B. mycoides картофель корень экссудата. Иными словами, протокол состоит из следующих этапов: во-первых, собирать картофель корень экссудата в стерильных условиях. Затем извлечь РНК высокого качества из бактериальных клетках, обработанных с корневой экссудата. Последним шагом является анализ данных, с помощью конвейера T-REx веб-14. Этот протокол был использован для идентификации генов б. mycoides , которые показывают изменения в уровнях выражения при контакте с корня экссудата и таким образом могли бы играть важную роль в завод микробных взаимодействий.
Protocol
Representative Results
Discussion
Завод микробных взаимодействий было предположить, чтобы определяться тонкое равновесие между бактерий и растений. Такого взаимодействия являются очень сложными и трудно изучать в природные системы, которая включает различных видов микроорганизмов, потенциально действуя как консорц…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Jakob Viel за его полезные замечания и предложения. Мы также благодарим Анн де Йонг за его помощь в анализе биоинформатики. Yanglei-Йи и ли Жибо поддерживаются Советом стипендии Китая (CSC). Мы благодарим NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (тки-AF-15510) за их финансовую поддержку в предустановочный набор OPK.
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
- Haichar, F. e. Z., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -. H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
