Plant-Microbe interactie: Transcriptionele reactie van Bacillus Mycoides op aardappel wortel exsudaat
Summary
Het doel van het hier gepresenteerde protocol is het bestuderen van de reactie van de transcriptomic van endosphere-geïsoleerde Bacillus mycoides op aardappel wortel exsudaat. Deze methode vereenvoudigt de identificatie van belangrijke bacteriële genen die betrokken zijn in plant-microbe interacties en is in principe van toepassing op andere endofyten en planten, met kleine aanpassingen.
Abstract
Nuttige plant-geassocieerde bacteriën spelen een belangrijke rol in het bevorderen van de groei en het voorkomen van de ziekte in planten. De toepassing van plant groeibevorderende rhizobacteria (PGPR) als biofertilizers of biocontrol agenten is uitgegroeid tot een effectief alternatief voor het gebruik van conventionele meststoffen en gewas productiviteit tegen lage kosten kan verhogen. Plant-microbe interacties, is afhankelijk van host plant-uitgescheiden signalen en een reactie erop door hun bijbehorende bacteriën. Echter reageren de moleculaire mechanismen van hoe nuttige bacteriën op de bijbehorende plantgerelateerde signalen worden niet volledig begrepen. Beoordeling van de reactie van de transcriptomic van bacteriën op wortel exsudaat is een krachtige aanpak om de bacteriële genexpressie en verordening onder rhizospheric omstandigheden. Deze kennis is noodzakelijk om te begrijpen van de onderliggende mechanismen die betrokken zijn in plant-microbe interacties. Dit witboek beschrijft een gedetailleerd protocol om te bestuderen van de transcriptomic reactie van B. mycoides EC18, een stam die geïsoleerd van de aardappel-endosphere, met exsudaat van de wortel van de aardappel. Met de hulp van recente hoge gegevensdoorvoer sequencing-technologie, kan dit protocol worden uitgevoerd in verschillende weken en produceren enorme datasets. Eerst, verzamelen we de wortel exsudaat onder steriele condities, waarna ze worden toegevoegd aan B. mycoides culturen. RNA van deze culturen is geïsoleerd met behulp van een fenol/chloroform methode in combinatie met een commerciële kit en onderworpen aan een kwaliteitscontrole door een geautomatiseerde elektroforese instrument. Na sequencing, data-analyse wordt uitgevoerd met de web gebaseerde T-REx-gasleiding en een groep van differentially uitgedrukte genen wordt geïdentificeerd. Deze methode is een nuttig instrument om nieuwe ontdekkingen op de bacteriële genen die betrokken zijn in plant-microbe interacties.
Introduction
Planten kunnen afgescheiden tot 20% van de koolstof vast tijdens de fotosynthese door wortels in de rhizosfeer1, dat wil zeggen, de smalle zone van de bodem in de buurt van de wortels. Als gevolg van de hogere beschikbaarheid van nutriënten is de rizosfeer een geschikt leefgebied voor verschillende micro-organismen, met inbegrip van plantengroei bevordering van bacteriën. De wortel exsudaat bevatten een aantal anorganische verbindingen als ionen, anorganische zuren, zuurstof en water. De meerderheid van de wortel exsudaat wordt echter gevormd door organische materialen, die kunnen worden onderverdeeld in laag molecuulgewicht verbindingen en ultrahoog moleculair gewicht verbindingen. De laagmoleculaire bestanddelen bevatten aminozuren, organische zuren, suikers, fenolische verbindingen, vetzuren en een array van secundaire metabolieten. De verbindingen van ultrahoog moleculair gewicht bestaan uit mucilage en eiwitten2,3. Rhizosfeer micro-organismen kunnen sommige van deze verbindingen gebruiken als een bron van energie voor groei en ontwikkeling. De wortel exsudaat spelen een belangrijke rol bij het vormgeven van de rhizobacterial Gemeenschap, omdat de plant-geproduceerde verbindingen in het exsudaat het gedrag van de rhizosfeer-geassocieerde bacteriën beïnvloeden kunnen door de expressie van specifieke genen beïnvloeden.
Inzicht in de bacteriële reactie op wortel exsudaat is een belangrijke stap in het ontcijferen van de plant-microbe interactie mechanismen. Zoals de bacteriële reactie op plant-microbe interacties het product van differentiële genexpressie is, kan het worden bestudeerd door transcriptome analyse. Met behulp van deze methode, vastgesteld eerdere studies verscheidene belangrijke genen die betrokken zijn in plant-microbe interacties. In Pseudomonas aeruginosa, genen die betrokken zijn in het metabolisme, chemotaxis en type II secretie geleerd om te reageren op de bieten wortel exsudaat van4. Sexy et al. 5 studeerde de transcriptomic profilering van B. amyloliquefaciens FZB42 in antwoord op maïs root exsudaat. Hun resultaten tonen aan dat van de genen sterk geïnduceerd door de wortel exsudaat, verschillende groepen bij betrokken zijn in de metabolische banen met betrekking tot het gebruik van de voedingsstoffen, chemotaxis, beweeglijkheid en niet-ribosomal synthese van antimicrobiële peptiden en polyketiden.
De nauwkeurigheid van deze studies, is afhankelijk van de hoeveelheid exsudaat van de wortel. Hoewel verschillende methoden de hoeveelheid exsudaat van de wortel voor verschillende doeleinden beschreven hebben, ze eisen van geavanceerde instrumenten of worden niet uitgevoerd in goed gecontroleerde omstandigheden6,7,8. Bovendien micro-organismen rhizosfeer-remmende invloed kunnen uitoefenen op wortel afgescheiden compositie door het beïnvloeden van de plant cel membraan permeabiliteit en beschadiging van de wortel weefsels, met name in het geval van consortia van micro-organismen9. Bij het onderzoeken van de microbiële reactie op wortel exsudaat, is het belangrijk om duidelijk omschreven Gebruiksvoorwaarden teneinde wijziging van de verbindingen met andere micro-organismen10. Bovendien, kwalitatief hoogwaardige RNA is nodig voor RNA-seq transcriptome studies gebaseerde. Echter, bij de behandeling van niet-model-bacteriële spanningen, de standaard protocollen of commerciële kits hebben meestal een lage efficiëntie als gevolg van onbekende factoren of speciale groei eigenschappen.
Het protocol hier beschreven werd geverifieerd met behulp van B. mycoides, die is een gram-positieve, spore-vormende bacterie van de Firmicute stam. Het is alomtegenwoordig in de rizosfeer van verschillende plantensoorten. Verschillende plant groei bevorderen van eigenschappen zijn gemeld voor deze soorten, waaronder inductie van systematische weerstand (ISR) in suikerbieten11, remming van de demping-off pathogen Pythium voor komkommer12, evenals stikstof fixatie in de rhizosfeer zonnebloem13. De moleculaire mechanismen van de interactie met een waardplant zijn echter niet goed bestudeerd.
Het doel van de experimenten die hier gepresenteerd is om te studeren van de reactie van de transcriptomic van endosphere-geïsoleerde B. mycoides op aardappel wortel exsudaat. Kortom, het protocol bestaat uit de volgende stappen: ten eerste, het verzamelen van exsudaat van de wortel van de aardappel onder steriele omstandigheden. Vervolgens uittreksel kwalitatief hoogwaardige RNA van bacteriecellen behandeld met exsudaat van de wortel. De laatste stap is de analyse van de gegevens met behulp van de web gebaseerde T-REx pijpleiding14. Dit protocol werd gebruikt voor het identificeren van B. mycoides genen die tonen een verschuiving in expressie niveaus bij contact met exsudaat van wortel en aldus een belangrijke rol kunnen spelen in plant-microbe interacties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plant-microbe interacties hebben zijn hypothetische nader te bepalen door een fijn afgestemde evenwicht tussen bacteriën en planten. Deze interacties zijn zeer complex en moeilijk te bestuderen in een natuurlijk systeem, die bestaat uit diverse microbiële soorten, potentieel hoedanigheid van consortia. Dit document beschrijft een vereenvoudigde protocol om te bestuderen van de bacteriële reactie op wortel exsudaat onder goed gecontroleerde omstandigheden. Het profiel van de transcriptome van rhizobacteria, bij blootst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Jakob Viel voor zijn nuttige opmerkingen en suggesties. Wij danken ook Anne de Jong voor zijn hulp bij de analyse van de bio-informatica. Yanglei Yi en Zhibo Li worden ondersteund door de China Scholarship Raad (CSC). Wij danken NWO-Trekweerstand Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) voor hun financiële steun aan de OPK.
Materials
| sodium hypochlorite | Sigma | CAS: 7681-52-9 | 10-15% active chlorine |
| Luria-Bertani (LB) broth | |||
| incubater | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Genesys 20 | |
| liquid nitrogen | |||
| glass beads | Sigma | G8893 | 0.5 µm |
| 2.0 ml tube with screw cap | RNase free | ||
| 1.5 ml and 2.0 ml eppendorf tube | RNase free | ||
| Bead mill homogenizer | BioSpec | 607 | Mini_beadbeater |
| centrifuge | Eppendorf | 5430 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | sigma | CAS: 1609-47-8 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | sigma | CAS: 151-21-3 | 10% solution prepared with DEPC treated MQ water |
| TE buffer | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8 | ||
| phenol | Sigma | RNA grade | |
| chloroform-isoamyl alcohol | prepare 24:1 of chloroform:isoamyl alcohol, store at room temperature | ||
| High pure RNA isolation kit | Roche | 11828665001 | |
| RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | RNase-Zap |
| Automated electrophoresis instrument | Agilent | 2100 | Bioanalyzer |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | Nanodrop ND-1000 | |
| RNA quality analysis kit | Agilent | RNA 6000 Nano kit | |
| RNase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | RiboLock | |
| Directional RNA library Prep kit | NEB | Ultra | For Illumina |
References
- Haichar, F. e. Z., et al. Plant host habitat and root exudates shape soil bacterial community structure. The ISME Journal: Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology. 2 (12), 1221-1230 (2008).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant, Cell & Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Rohrbacher, F., St-Arnaud, M. Root exudation: the ecological driver of hydrocarbon rhizoremediation. Agronomy Journal. 6 (1), 19 (2016).
- Mark, G. L., et al. Transcriptome profiling of bacterial responses to root exudates identifies genes involved in microbe-plant interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17454-17459 (2005).
- Fan, B., et al. Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudates. BMC Microbiology. 12 (1), 116 (2012).
- Yoshitomi, K. J., Shann, J. R. Corn (Zea mays L.) root exudates and their impact on 14C-pyrene mineralization. Soil Biology and Biochemistry. 33 (12), 1769-1776 (2001).
- Lambert, M. R. Clover root exudate produces male-biased sex ratios and accelerates male metamorphic timing in wood frogs. Royal Society Open Science. 2 (12), (2015).
- Tuason, M. M. S., Arocena, J. M. Root organic acid exudates and properties of rhizosphere soils of white spruce (Picea glauca) and subalpine fir (Abies lasiocarpa). Canadian Journal of Soil Science. 89 (3), 287-300 (2009).
- Grayston, S. J., Vaughan, D., Jones, D. Rhizosphere carbon flow in trees, in comparison with annual plants: the importance of root exudation and its impact on microbial activity and nutrient availability. Applied Soil Ecology. 5 (1), 29-56 (1997).
- Rovira, A. D. Plant root exudates. Botanical Review. 35 (1), 35-57 (1969).
- Bargabus, R. L., Zidack, N. K., Sherwood, J. E., Jacobsen, B. J. Characterisation of systemic resistance in sugar beet elicited by a non-pathogenic, phyllosphere-colonizing Bacillus mycoides, biological control agent. Physiological and Molecular Plant Pathology. 61 (5), 289-298 (2002).
- Peng, Y. -. H., et al. Inhibition of cucumber Pythium damping-off pathogen with zoosporicidal biosurfactants produced by Bacillus mycoides. Journal of Plant Diseases and Protection. 124 (5), 481-491 (2017).
- Ambrosini, A., et al. Diazotrophic bacilli isolated from the sunflower rhizosphere and the potential of Bacillus mycoides B38V as biofertiliser. Annals of Applied Biology. 168 (1), 93-110 (2016).
- de Jong, A., van der Meulen, S., Kuipers, O. P., Kok, J. T-REx: transcriptome analysis webserver for RNA-seq expression data. BMC Genomics. 16 (1), 663 (2015).
- Yi, Y., de Jong, A., Frenzel, E., Kuipers, O. P. Comparative transcriptomics of Bacillus mycoides strains in response to potato-root exudates reveals different genetic adaptation of endophytic and soil isolates. Frontiers in Microbiology. 8, 1487 (2017).
- Nwokeoji, A. O., Kilby, P. M., Portwood, D. E., Dickman, M. J. RNASwift: a rapid, versatile RNA extraction method free from phenol and chloroform. Analytical Biochemistry. 512, 36-46 (2016).
- Ramirez-Gonzalez, R. H., Bonnal, R., Caccamo, M., MacLean, D. Bio-samtools: Ruby bindings for SAMtools, a library for accessing BAM files containing high-throughput sequence alignments. Source Code for Biology and Medicine. 7 (1), 6 (2012).
- Quinlan, A. R. BEDTools: the Swiss-army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. , (2014).
- Boria, I., Boatti, L., Pesole, G., Mignone, F. NGS-trex: next generation sequencing transcriptome profile explorer. BMC Bioinformatics. 14 (7), S10 (2013).
