כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדור של pluripotent המושרה בתאי גזע (iPSCs) מ תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית (הסימולטור) החולה נגזר fibroblasts, הבידול של iPSCs באמצעות גזע mesenchymal (MSCs) תאי העצם, מידול vivo tumorigenesis באמצעות תאי העצם של החולה-derived הסימולטור.
תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית (הסימולטור) היא הפרעת סרטן תורשתית אוטוזומלית דומיננטית. חולים עם הסימולטור הן נטייה סוג שונים של גידולים, כולל אוסטאוסרקומה–אחד הראשית בתדירות הגבוהה ביותר-המטולוגיות ממאירות ב הילדות וההתבגרות. לכן, הסימולטור מספק מודל אידיאלי ללמוד זה גידול ממאיר. ניצול של מתודולוגיות iPSC, אוסטאוסרקומה הסימולטור-הקשורים שניתן למדל בהצלחה על ידי הבחנה הסימולטור החולה iPSCs גזע mesenchymal (MSCs), ולאחר מכן תאי העצם, תאי המוצא לכל osteosarcomas. אלו תאי העצם הסימולטור מסכם את הדברים oncogenic מאפייני אוסטאוסרקומה, מתן מערכת מודל אטרקטיבי עבור בהתוויית בפתוגנזה של אוסטאוסרקומה. כתב יד זה מדגים את פרוטוקול לדור של iPSCs של הסימולטור fibroblasts החולה, הבידול של iPSCs כדי MSCs, הבידול של MSCs תאי העצם, ויוו tumorigenesis באמצעות הסימולטור תאי העצם. ניתן להרחיב מודל המחלה זה iPSC לזיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים או מטרות טיפוליות הקשורות הסימולטור אוסטאוסרקומה.
בין 2006 ו 2007, מספר ממצאים פריצת דרך המעבדות של ד”ר Shinya יאמאנאקה, ג’יימס א. תומסון הוביל את הפיתוח של pluripotent המושרה בתאי גזע (iPSCs)1,2,3. על ידי התכנות תאים סומטיים עם גורמים תעתיק מוגדר שיש טופס iPSCs, החוקרים הצליחו לייצר תאים בעלי מאפיינים מרכזיים כלומר, pluripotency, התחדשות עצמית, אשר נחשב בעבר רק קיימים תאי גזע עובריים (hESCs). iPSCs יכולים להיווצר מכל אדם או חולה, לא היו צריכים להיגזר עוברי, במידה רבה להרחיב את הרפרטואר של מחלות זמין ורקעים לצורך המחקר. מאז, החולה, נגזר iPSCs שימשו כדי לסכם את פנוטיפ של מחלות אנושיות שונות, מחלת אלצהיימר4 ו נוירודגנרטיביות5 זמן QT תסמונת6,7, 8.
ההתפתחויות הללו במחקר iPSC גם נפתחו דרכים חדשות לחקר הסרטן. מספר קבוצות לאחרונה השתמשו iPSCs החולה מודל לפיתוח סרטן תחת הרקע הגנטי רגישים9,10,11, עם יישום מוצלח הפגינו לתאריך אוסטאוסרקומה9, לוקמיה10,11,12, סרטן המעי הגס13. למרות סרטן נגזר iPSC מודלים בחיתוליהם, הדגים פוטנציאל גדול ב phenocopying הקשורים למחלות ממאירות, שחקרתי מנגנונים פתולוגי, וזיהוי תרכובות טיפולית14.
תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית (הסימולטור) היא הפרעת אוטוזומלית דומיננטית סרטן תורשתית הנגרמת על ידי מוטציה germline TP53 15. חולים עם הסימולטור נטייה סוג שונים של ממאירות כולל אוסטאוסרקומה, שהופך iPSCs הסימולטור תאי נגזר שלהם במיוחד מתאים היטב ללמוד זה גידול ממאיר16. מודל מבוסס iPSC אוסטאוסרקומה הוקם לראשונה בשנת 2015 באמצעות הסימולטור החולה נגזר iPSCs9 לאחר מכן הבדיל לתוך גזע mesenchymal (MSCs), ואז על תאי העצם, שמקורם תאים של אוסטאוסרקומה. אלו תאי העצם הסימולטור מסכם את הדברים הקשורים אוסטאוסרקומה בידול osteogenic פגמים ומאפיינים oncogenic, הדגמת המודל פוטנציאליים כפלטפורמה “סרטן העצמות בצלחת”. מעניין, ניתוחים ברמת הגנום transcriptome להציג היבטים של חתימה ג’ין אוסטאוסרקומה בתוך הסימולטור תאי העצם, זה תכונות של פרופיל ביטוי גנטי זה הסימולטור נמצאים בקורלציה עם פרוגנוזה גרועה אצל אוסטאוסרקומה9, המציין הפוטנציאל של הסימולטור iPSCs המחלה מודלים כדי לחשוף את התכונות של הרלוונטיות הקלינית.
כתב יד זה מספק תיאור מפורט של אופן השימוש הסימולטור החולה נגזר iPSCs כדי אוסטאוסרקומה מודל. זה מפרט את הדור של הסימולטור iPSCs, הבידול של iPSCs MSCs ולאחר מכן על תאי העצם, ושימוש ויוו xenograft מודל באמצעות הסימולטור תאי העצם. המודל המחלה הסימולטור כוללת מספר יתרונות, ובראשם את היכולת לייצר תאים ללא הגבלה בכל שלבי ההתפתחות אוסטאוסרקומה מחקרים מכניסטית, סמן זיהוי של סמים הקרנת9,14, 16.
לסיכום, המודל מבוסס iPSC אוסטאוסרקומה הסימולטור מציע מערכת משלים אטרקטיבי לקידום המחקר אוסטאוסרקומה. פלטפורמה זו מספקת גם הוכחה-של-קונספט דוגמנות סרטן באמצעות החולה נגזר iPSCs. אסטרטגיה זו המתוארת להלן ניתן להרחיב בקלות את מודל ממאירות הקשורות סרטן נטיות גנטיות אחרות.
כדי להשיג יעילות גבוהה יותר של בידול MSC, מספר היבטים הם קריטיים. אחת היא התנאי התרבות של iPSCs לפני ביצוע MSC בידול. פרוטוקול שהוצג בחוברת מתבסס על מחקרים קודמים 9,17. iPSCs צריך להיות בתרבית על MEFs לפחות 2 שבועות. שמירה על iPSCs טובים תנאים על MEFs הם קריטיים עבור תאים לצרף ?…
The authors have nothing to disclose.
ר צ נתמך על ידי חדשנות UTHealth עבור סרטן מניעה מחקר הכשרה תוכנית Pre-Doctoral לאגודה (מניעת סרטן, טקסס של מכון המחקר להעניק RP160015). ג’יי. טי נתמך על-ידי התוכנית לין הקי של האוניברסיטה הראשונה המזוהה עם בית החולים של סון יאט-סן. ד-F.L. המלומד CPRIT בחקר הסרטן, נתמך על ידי NIH השביל המוביל אל העצמאות פרס R00 CA181496 ו- CPRIT פרס RR160019.
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |