ここでは、プロトコルを提案誘導多能性幹細胞 (Ips) の世代の李 Fraumeni シンドローム (LFS) 患者派生繊維芽細胞、間葉系幹細胞 (MSCs) 経由で Ips の分化から骨芽細胞、およびモデリングの体内にLFS 患者由来骨芽細胞を用いた腫瘍。
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この記事について
サマリー
要約
李 Fraumeni シンドローム (LFS) は常染色体優性遺伝性の癌疾患です。LFS 患者は、各種腫瘍、骨肉腫 - 小児期と思春期の最も頻繁な主な非造血器腫瘍の 1 つを含むためにし向けられます。したがって、LFS は、この悪性腫瘍の研究に理想的なモデルを提供します。IPSC の方法論の活用 LFS 関連骨肉腫は、LFS 患者 Ips 間葉系幹細胞 (MSCs) し、骨芽細胞 ― ― osteosarcomas の元の細胞を分化によって正常にモデル化できます。これらの LFS の骨芽細胞は発癌性骨肉腫、骨肉腫の発生機序を区切るための魅力的なモデル システムを提供する要約します。この原稿は、LFS 患者線維芽細胞、MSCs では、骨芽細胞と LFS 骨芽細胞を用いた生体内で腫瘍の分化に Ips の分化から Ips の生成のためのプロトコルを示します。この iPSC 病モデルは、潜在的なバイオ マーカーや LFS 関連骨肉腫の治療上のターゲットを識別するために拡張できます。
概要
2006 年と 2007 の間山中伸弥夫妻とジェームス a. トムソンの研究所からいくつかの画期的な所見は誘導多能性幹細胞 (Ips)1,2,3の開発につながった。フォーム Ips に定義された転写因子と体細胞をリプログラミング研究者すなわちキー特性を持つ細胞を生成することができた、ヒト胚性幹細胞の存在、多能性と自己複製するだけで以前考えられていた(hESCs)。Ips は、個人または患者から生成される可能性があり、大幅に利用できる病気の研究のための背景のレパートリーを拡大して胚に由来するはありませんでした。以来、患者由来の Ips がアルツハイマー病4筋萎縮性側索硬化症5長い QT シンドローム6,7,から、様々 な人間の病気の表現型を要約するために使用されています。8。
IPSC 研究のこれらの進歩はまた癌研究のための新しい道を開いています。いくつかのグループ最近骨肉腫9<....
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プロトコル
この作品は、テキサス大学健康科学センター ヒューストン (UTHealth) 動物福祉委員会によって承認されました。実験は、実験室の動物薬・気 (CLAMC) 研究室動物の世話 (AAALAC インターナショナル) のアメリカの協会によって認定されているため UTHealth センターによって確立された基準に厳密に従ってで実行されます。本研究の人間の題材は、NIH の SF424 のドキュメントで定義されているシナリオ、(「いいえ人間被験者研究」) の下で落ちる。したがって、それは、UTHealth 人間研究倫理委員会の承認は不要です。
1. LFS Ips (図 1 a) の生成
- -2 日 6 ウェル プレートのウェル 1 個に 2 × 104 LFS 患者線維芽細胞をプレートし、5% の加湿で 37 ° C で線維芽細胞培地 (表 1) で細胞の培養 CO2インキュベーター。繊維芽細胞伝達 (0 日) の日に 50 ~ 60% の合流点に達することを確認します。
- 0 日目にセンダイ ウイルス伝達を実行します。これを行うには、予め温めておいた線維芽細胞培地で過ごした媒体を交換してください。雪解けの氷の上 (材料の表を参照) をキット ウイルス リプログラミング商業仙....
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結果
このプロトコルは、LFS iPSC 世代、MSC 分化、骨芽細胞分化・ LFS MSC 由来骨芽細胞を用いた腫瘍生体内で試金プロシージャを示します。
LFS リプログラミング キット市販センダイ ウイルスを用いた線維芽細胞から Ips の生成のための方式は、図 1 aに表示されます。山中 4 因子のセンダイ ウイルス ベースの配布は、非統合プログラムし直す方法です。したがって、安定した LFS iPSC クローンはセンダイ ウイルス ゲノムと外因性 OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC 遺伝子 (図 1 b) 特異的プライマーを用いた RT-PCR 法により検査することができるの損失無料する必要があります。製造元の指示にお勧め、センダイ ウイルス無料 Ips の世代文化と通路の両方の条件に依存します。このプロトコ.......
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ディスカッション
MSC 分化効率化を実現するには、いくつかの側面が重要です。MSC 分化を開始する前に Ips の培養条件であります。原稿で示されるプロトコルは、前研究9,17に基づいています。Ips は、少なくとも 2 週間は MEFs に培養する必要があります。良い Ips を維持する MEFs の条件は MSC 分化用ゼラチン コーティング プレートを付けるように細胞にとって重要です。もう一つの重要な側面は、分化前に、MEFs に Ips の密度です。80 - Ips の 90% の confluency MSC 分化を開始するためお勧めします。Ips の増殖は分化過程の細胞生存率が低下します。MSC 分化を開始するとき、最後の重要なポイントは播種密度です。私たちの手で細胞密度の高いゼラチン コーティング プレートに iPSC 添付ファイルを推進しています。1 つ 100 mm ディッシュ Ips は、6 ウェル プレートの 3 つの井戸にシードすることができます。直接再と MSC 分化培地で Ips のめっきによる MSC 分化.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
R. Z.、がん予防の研究研修プログラム呼称される交わり (がん予防・ RP160015 を与えるテキサスの研究所) UTHealth 技術革新によってサポートされます。JT は、最初提携病院の孫逸仙大学の柯林プログラムによってサポートされます。D. f. l. は、がん研究の CPRIT 学者で NIH 経路独立賞 R00 CA181496 と CPRIT 賞 RR160019 でサポートされています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| プラスチック製品 | |||
| 100 mm ディッシュ | コーニング | 430107 | |
| 60 mm ディッシュ | コーニング | 430166 | |
| 6 ウェル プレート | ファルコン | 353046 | |
| 12 ウェル プレート | ファルコン | 353043 | |
| 48 ウェル プレート | ファルコン | 353078 | |
| 1 mLピペットチップ | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL ピペットチップ | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL ピペットチップ | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL 血清ピペット | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL 血清ピペット | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL 血清ピペット | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL チューブ、PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL チューブ、PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 仙台ウイルス リプログラミングキット | Invitrogen | A16517 | 商用仙台ウイルス リプログラミングキット |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, 照射済み | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | シグマ-アルドリッチ | D5671 | |
| DMEM/F12 | コーニング | 10-090-CV& | |
| alpha;MEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | 商用iPSCミディアム |
| ノックアウト DMEM/F-12 | サーモフィッシャー | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| ノックアウト血清交換 | サーモフィッシャー | A3181502 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM 非必須アミノ酸 | コーニング | 25-025-CI | |
| L-グルタミン溶液 | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-メルカプトエタノール | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| ヒト FGF-塩基性 (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| 組換えヒト PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-グリセロリン酸 | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| デキサメタゾン | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| アスコルビン酸 | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | 市販の継代液 |
| Accutatse 細胞剥離液 | Corning | 25-058-CI | 細胞剥離液 |
| チアゾビビン(ROCK阻害剤) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
| ヒト NANOG 抗体 | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 抗体 (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&Dシステム | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 マウス 抗ヒト TRA-1-81 抗原 | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 ロバ 抗ヤギ IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE マウス 抗ヒト CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC マウス 抗ヒト CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE マウス 抗ヒト CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE マウス 抗ヒト CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC マウス 抗ヒト CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| ヤギの血清 | ジャクソン免疫研究 | 005-000-121 | |
| アルカリホスファターゼ染色キットII | ステムジェント | 00-0055 | |
| アリザリンレッド | S シグマ-アルドリッチ | A5533 | |
| トリゾール試薬 | サーモフィッシャー | 15596018 | |
| クロロホルム | サーモフィッシャー | C298-500 | |
| 2-プロパノール | サーモフィッシャー | A416-4 | |
| エタノール、アブソリュート、分子生物学グレード | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I、RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green | Supermix BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Corning | 354262 | ||
| 1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch DB | Biosciences | 309597 |
参考文献
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult h....
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再版と許可
