ここでは、プロトコルを提案誘導多能性幹細胞 (Ips) の世代の李 Fraumeni シンドローム (LFS) 患者派生繊維芽細胞、間葉系幹細胞 (MSCs) 経由で Ips の分化から骨芽細胞、およびモデリングの体内にLFS 患者由来骨芽細胞を用いた腫瘍。
李 Fraumeni シンドローム (LFS) は常染色体優性遺伝性の癌疾患です。LFS 患者は、各種腫瘍、骨肉腫 – 小児期と思春期の最も頻繁な主な非造血器腫瘍の 1 つを含むためにし向けられます。したがって、LFS は、この悪性腫瘍の研究に理想的なモデルを提供します。IPSC の方法論の活用 LFS 関連骨肉腫は、LFS 患者 Ips 間葉系幹細胞 (MSCs) し、骨芽細胞 ― ― osteosarcomas の元の細胞を分化によって正常にモデル化できます。これらの LFS の骨芽細胞は発癌性骨肉腫、骨肉腫の発生機序を区切るための魅力的なモデル システムを提供する要約します。この原稿は、LFS 患者線維芽細胞、MSCs では、骨芽細胞と LFS 骨芽細胞を用いた生体内で腫瘍の分化に Ips の分化から Ips の生成のためのプロトコルを示します。この iPSC 病モデルは、潜在的なバイオ マーカーや LFS 関連骨肉腫の治療上のターゲットを識別するために拡張できます。
2006 年と 2007 の間山中伸弥夫妻とジェームス a. トムソンの研究所からいくつかの画期的な所見は誘導多能性幹細胞 (Ips)1,2,3の開発につながった。フォーム Ips に定義された転写因子と体細胞をリプログラミング研究者すなわちキー特性を持つ細胞を生成することができた、ヒト胚性幹細胞の存在、多能性と自己複製するだけで以前考えられていた(hESCs)。Ips は、個人または患者から生成される可能性があり、大幅に利用できる病気の研究のための背景のレパートリーを拡大して胚に由来するはありませんでした。以来、患者由来の Ips がアルツハイマー病4筋萎縮性側索硬化症5長い QT シンドローム6,7,から、様々 な人間の病気の表現型を要約するために使用されています。8。
IPSC 研究のこれらの進歩はまた癌研究のための新しい道を開いています。いくつかのグループ最近骨肉腫9日に成功したアプリケーション モデル発がん感受性の遺伝的背景9,10、11、下に患者の Ips を使用しています。白血病10、11,12、および大腸癌13。IPSC 由来癌モデルがまだ初期の段階、phenocopying 病関連の悪性腫瘍、病理組織学的機構の解明と治療化合物14の識別の大きな可能性を示しています。
李 Fraumeni シンドローム (LFS)、15 TP53生殖細胞の突然変異によって引き起こされる常染色体優性遺伝性の癌疾患です。LFS 患者は、この悪性腫瘍16の勉強に特に適して LFS Ips とその派生の細胞を作る各種、骨肉腫などの悪性腫瘍にし向けられます。骨肉腫の iPSC ベース モデル設立当初 2015 年に間葉系幹細胞 (MSCs) に区別されその後 LFS 患者由来 Ips9を使用して、元の細胞の骨芽細胞に、骨肉腫の。これらの LFS 骨芽細胞骨肉腫の骨分化障害とモデル”皿に骨腫瘍「プラットフォームとして可能性を示す発癌性特性を要約するでしょう。興味深いことに、ゲノム ・ トランスクリプトーム解析は、LFS 骨芽細胞骨肉腫遺伝子署名の側面を明らかにしてこの LFS 遺伝子発現プロファイルの機能は、骨肉腫9, 予後と相関を示す、潜在的な LFS Ips 疾患モデルの臨床関連性の特徴を明らかにします。
この原稿は、LFS 患者由来 Ips モデル骨肉腫を使用する方法の詳細な説明を提供します。それは世代 LFS Ips、Ips MSCs にし、骨芽細胞に分化し、LFS 骨芽細胞を用いた生体内で異種移植モデルの使用の詳細します。LFS 疾患モデルにいくつかの利点、特に解明、バイオ マーカーの同定と創薬スクリーニング9,14、骨肉腫の開発のすべての段階で無制限のセルを生成する機能が装備されています。 16。
要約すると、LFS 骨肉腫の iPSC ベース モデルは、骨肉腫の研究を推進するための魅力的な相補的なシステムを提供しています。このプラットフォームは、患者由来の Ips を用いた癌のモデル化の概念実証を提供します。以下のこの戦略は、がん素因とその他の遺伝性疾患に関連付けられているモデルの悪性腫瘍を容易に拡張することができます。
MSC 分化効率化を実現するには、いくつかの側面が重要です。MSC 分化を開始する前に Ips の培養条件であります。原稿で示されるプロトコルは、前研究9,17に基づいています。Ips は、少なくとも 2 週間は MEFs に培養する必要があります。良い Ips を維持する MEFs の条件は MSC 分化用ゼラチン コーティング プレートを付けるように細胞にとって重要で?…
The authors have nothing to disclose.
R. Z.、がん予防の研究研修プログラム呼称される交わり (がん予防・ RP160015 を与えるテキサスの研究所) UTHealth 技術革新によってサポートされます。JT は、最初提携病院の孫逸仙大学の柯林プログラムによってサポートされます。D. f. l. は、がん研究の CPRIT 学者で NIH 経路独立賞 R00 CA181496 と CPRIT 賞 RR160019 でサポートされています。
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |