Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di induced pluripotent Stem Cells (iPSCs) da fibroblasti derivata pazienti di sindrome di Li-Fraumeni (LFS), differenziazione delle iPSCs tramite cellule staminali mesenchimali (MSCs) di osteoblasti e modellazione in vivo tumorigenesi utilizzando osteoblasti derivati paziente LFS.
Sindrome di Li-Fraumeni (LFS) è un disordine ereditario dominante autosomal del cancro. I pazienti con LFS sono predisposti a un tipo di vari tumori, compreso osteosarcoma..–una delle malignità primaria non ematologica più frequente nell’infanzia e nell’adolescenza. Di conseguenza, LFS fornisce un modello ideale per studiare questa malignità. Approfittando delle metodologie iPSC, osteosarcoma LFS-collegato può essere modellato con successo differenziando LFS iPSCs paziente alle cellule staminali mesenchimali (MSCs) e quindi di osteoblasti, le cellule di origine per gli osteosarcomi. Questi osteoblasti LFS ricapitolano proprietà oncogeniche di osteosarcoma, fornendo un sistema di modello attraente per delineare la patogenesi di osteosarcoma. Questo manoscritto viene illustrato un protocollo per la generazione di iPSCs da fibroblasti pazienti di LFS, differenziazione delle iPSCs per MSCs, differenziazione di cellule staminali mesenchimali di osteoblasti e tumorigenesi in vivo utilizzando osteoblasti LFS. Questo modello di malattia di iPSC può essere esteso per identificare potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici per LFS-collegati di osteosarcoma.
Tra il 2006 e 2007, parecchi risultati di svolta dai laboratori di DRS. Shinya Yamanaka e James A. Thomson ha condotto allo sviluppo di pluripotenti indotte (iPSCs) le cellule staminali1,2,3. Di riprogrammare le cellule somatiche con definiti fattori trascrizionali a forma iPSCs, i ricercatori sono stati in grado di generare cellule con caratteristiche chiave, vale a dire, pluripotenza e auto-rinnovamento, che era precedentemente pensato solo esistono in cellule staminali embrionali umane (hESC). iPSCs potrebbe essere generato da qualsiasi individuo o il paziente e non ha dovuto essere derivate da embrioni, ampliando enormemente il repertorio delle malattie disponibili e sfondi gratis per lo studio. Da allora, iPSCs derivate dal paziente sono stati usati per ricapitolare il fenotipo di varie malattie umane, da morbo di Alzheimer4 e sclerosi laterale amiotrofica5 a lungo QT sindrome6,7, 8.
Questi avanzamenti nella ricerca di iPSC hanno anche aperto nuove strade per la ricerca sul cancro. Diversi gruppi hanno recentemente utilizzato iPSCs paziente allo sviluppo del cancro modello sotto un background genetico suscettibile9,10,11, con applicazione di successo ha dimostrata fino ad oggi in osteosarcoma9, leucemia10,11,12e13di cancro colorettale. Anche se modelli iPSC-derivato del cancro sono ancora nella loro infanzia, hanno dimostrato grande potenziale nella malignità phenocopying malattia-collegate, delucidare i meccanismi patologici e identificando i composti terapeutici14.
Sindrome di Li-Fraumeni (LFS) è un disordine ereditario dominante autosomal del cancro causato dalla mutazione di TP53 germline15. Pazienti con LFS sono predisposti a un vario tipo di malignità compreso osteosarcoma, rendendo particolarmente adatto allo studio di questa malignità16LFS iPSCs e le loro cellule derivate. Un modello basato su iPSC osteosarcoma è stato fondato nel 2015 utilizzando LFS iPSCs derivate paziente9 successivamente differenziate in cellule staminali mesenchimali (MSCs) e quindi di osteoblasti, l’originario cellule di osteosarcoma. Questi osteoblasti LFS ricapitolano osteosarcoma-collegata la differenziazione osteogenica difetti e proprietà oncogene, che dimostra il potenziale come una piattaforma di “tumore dell’osso in un piatto” modello. È interessante notare che, genoma transcriptome analisi rivelano aspetti di una firma del gene di osteosarcoma in osteoblasti LFS e che caratteristiche di questo profilo di espressione genica LFS sono correlate con la prognosi difficile in osteosarcoma9, che indica la potenziale di modelli di malattia iPSCs LFS a rivelare le caratteristiche di rilevanza clinica.
Questo manoscritto fornisce una descrizione dettagliata di come utilizzare LFS iPSCs derivate dal paziente all’osteosarcoma di modello. Vi si descrive la generazione di LFS iPSCs, differenziazione delle iPSCs a MSCs e poi di osteoblasti e l’uso di un modello in vivo dello xenotrapianto utilizzando osteoblasti LFS. Il modello di malattia LFS presenta diversi vantaggi, in particolare la capacità di generare cellule illimitate in tutte le fasi di sviluppo di osteosarcoma per studi meccanicistici, identificazione di biomarker e9,14, di screening di stupefacenti 16.
In sintesi, il modello di base di iPSC osteosarcoma LFS offre un attraente sistema complementare per far progredire la ricerca di osteosarcoma. Questa piattaforma fornisce anche un proof-of-concept per la modellazione di cancro usando iPSCs derivate dal paziente. Questa strategia descritta di seguito può essere facilmente esteso alle malignità di modello associata con altri disordini genetici con predisposizioni di cancro.
Per raggiungere una maggiore efficienza di differenziazione di MSC, alcuni aspetti sono fondamentali. Uno è la condizione di cultura di iPSCs prima dell’inizio della differenziazione di MSC. Il protocollo presentato nel manoscritto si basa su precedenti studi 9,17. iPSCs devono essere coltivate su MEFs per almeno 2 settimane. Mantenere iPSCs in buone condizioni su MEFs sono critiche per celle fissare la piastra rivestite con gelatina per il differenziamento di M…
The authors have nothing to disclose.
R. Z. è supportato da UTHealth innovazione per cancro Prevenzione ricerca formazione programma corso Fellowship (prevenzione del cancro e Istituto di ricerca del Texas concedere RP160015). J.T. è supportato dal programma Ke Lin dell’Università ospedale affiliato prima di Sun Yat-sen. D.-F.L. è lo studioso CPRIT nella ricerca sul cancro e supportato da NIH via indipendenza Premio R00 CA181496 e CPRIT premio RR160019.
Plastic ware | |||
100 mm Dish | Corning | 430107 | |
60 mm Dish | Corning | 430166 | |
6-well Plate | Falcon | 353046 | |
12-well Plate | Falcon | 353043 | |
48-well Plate | Falcon | 353078 | |
1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
Culture materials and Reagents | |||
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
αMEM | Corning | 10-022-CV | |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |