Modellering Osteosarcoma bruker Li-Fraumeni syndrom pasient-avledede Induced Pluripotent stamceller

Summary

Her presenterer vi en protokoll for generering av indusert pluripotent stamceller (iPSCs) fra Li-Fraumeni syndrom (AKU) pasienten avledede fibroblaster, differensiering av iPSCs via stamceller (MSCs) osteoblasts og modellering i vivo tumorigenesis bruker AKU pasient-avledede osteoblasts.

Abstract

Li-Fraumeni syndrom (AKU) er en autosomal dominant arvelig kreft lidelse. Pasienter med AKU er disponert for ulike typen svulster, herunder osteosarcoma – en av de mest primære ikke-hematologic malignitet i barndom og oppvekst. AKU gir derfor en ideell modell for å studere denne kreft. Utnytter iPSC metoder, AKU-assosiert osteosarcoma kan modelleres vellykket ved å skille AKU pasienten iPSCs til stamceller (MSCs), og deretter til osteoblasts – cellene i opprinnelse for osteosarcomas. Disse AKU osteoblasts recapitulate kreftfremkallende egenskaper osteosarcoma, gir en attraktiv modellsystem for skildre patogenesen av osteosarcoma. Dette manuskriptet viser en protokoll for generering av iPSCs fra AKU pasienten fibroblaster, differensiering av iPSCs til MSCs, differensiering av MSCs osteoblasts, og i vivo tumorigenesis bruker AKU osteoblasts. Denne iPSC sykdom modell kan utvides for å identifisere potensielle biomarkers eller terapeutisk mål for AKU-assosiert osteosarcoma.

Introduction

Mellom 2006 og 2007 førte flere gjennombrudd funn fra laboratoriene Dr. Shinya Yamanaka og James A. Thomson til utvikling av menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs)^1,2,3. Omprogrammere somatiske celler med definerte transcriptional faktorer til skjemaet iPSCs, forskerne kunne generere celler med viktige egenskaper nemlig, pluripotency og selvtillit fornyelse, som var tidligere antatt å bare finnes i menneskelige embryonale stamceller (hESCs). iPSCs kan genereres fra individ eller pasienten og måtte ikke være avledet fra embryo, vesentlig utvide repertoaret tilgjengelig sykdommer og bakgrunner for studier. Siden da har pasient-avledede iPSCs blitt brukt til recapitulate fenotypen av ulike menneskelige sykdommer, Alzheimers sykdom⁴ og amyotrofisk lateral sklerose⁵ lang QT syndrom^{6,7, 8}.

Disse fremskrittene i iPSC forskning har også åpnet nye muligheter for kreftforskning. Flere grupper har nylig brukt pasienten iPSCs modell kreft utvikling under en utsatt genetisk bakgrunn^9,10,11med vellykket program vist hittil i osteosarcoma⁹, leukemi^10,11,12og endetarmskreft¹³. Selv om iPSC-avledet kreft modeller er fortsatt i sin barndom, har de vist stort potensial i phenocopying sykdomsassosierte malignitet, Klargjørende patologisk mekanismer, og identifisere terapeutiske forbindelser¹⁴.

Li-Fraumeni syndrom (AKU) er en autosomal dominant arvelig kreft lidelse forårsaket av TP53 germline mutasjon¹⁵. Pasienter med AKU er disponert for ulike typen malignitet inkludert osteosarcoma, gjør AKU iPSCs og deres avledet celler spesielt godt egnet til å studere denne malignitet¹⁶. En iPSC-baserte osteosarcoma modell først ble etablert i 2015 bruker AKU pasient-avledede iPSCs⁹ senere differensiert til stamceller (MSCs) og deretter til osteoblasts, de stammer cellene av osteosarcoma. Disse AKU osteoblasts recapitulate osteosarcoma-assosiert osteogenic differensiering defekter og kreftfremkallende egenskaper, demonstrere modellen potensielle som “bein svulst i en rett” plattform. Interessant, genomet hele transcriptome analyser åpenbare aspekter av en osteosarcoma genet signatur i AKU osteoblasts og som kjennetegner denne AKU gene expression profilen er korrelert med dårlig prognose i osteosarcoma⁹, som angir den potensialet i AKU iPSCs sykdom modeller å avsløre funksjoner kliniske relevans.

Dette manuskriptet gir en detaljert beskrivelse av hvordan du bruker AKU pasient-avledede iPSCs til modell osteosarcoma. Det detaljer generering av AKU iPSCs, differensiering av iPSCs MSCs og deretter til osteoblasts, og bruk av en i vivo xenograft modellen med AKU osteoblasts. AKU sykdom modellen består av flere fordeler, blant annet muligheten til å generere ubegrenset celler i alle stadier av osteosarcoma utvikling for mekanistisk studier, biomarkør identifikasjon og narkotikarelaterte screening^{9,14, 16}.

Oppsummert tilbyr AKU iPSC-baserte osteosarcoma modellen en attraktiv komplementære system for fremme osteosarcoma forskning. Denne plattformen gir også en proof-of-concept for kreft modellering bruker pasient-avledede iPSCs. Denne strategien beskrevet nedenfor kan lett utvides til modell malignitet forbundet med andre genetiske lidelser med kreft predisposisjoner.

Protocol

Dette arbeidet ble godkjent av University of Texas Health Science Center i Houston (UTHealth) dyr velferd komiteen. Eksperimenter utføres i henhold med standardene etablert av UTHealth sentrum laboratoriet dyr medisin & Care (CLAMC) som er akkreditert av American Association for laboratoriet Animal Care (AAALAC International). Menneskelig fag i denne studien faller under scenariet en (“ingen menneskelig fag forskning”) som definert ved NIH SF424 dokumentasjon. Derfor trenger det ikke noen godkjenning av UTHealth mennesk…

Representative Results

Denne protokollen presenterer prosedyrer inkludert AKU iPSC generasjon MSC differensiering, osteoblast differensiering og i vivo tumorigenesis analysen bruker AKU MSC-avledet osteoblasts. Ordningen for generering av AKU iPSCs fra fibroblaster ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig Sendai virus omprogrammering kit er vist i figur 1A. Sendai virus-basert levering Yamanaka fire faktorer er i…

Discussion

For å oppnå høyere MSC differensiering effektivitet, er flere aspekter avgjørende. En er kultur tilstand iPSCs før du starter MSC differensiering. Protokollen presentert i manuskriptet er basert på tidligere studier ^9,17. iPSCs må være kultivert på MEFs i minst 2 uker. Opprettholde iPSCs i god er forholdene på MEFs avgjørende for cellene til fest på den gelatin-belagt platen for MSC differensiering. En annen viktig aspekt er tettheten av iPSCs på MEF…

Materials

Plastic ware
100 mm Dish	Corning	430107
60 mm Dish	Corning	430166
6-well Plate	Falcon	353046
12-well Plate	Falcon	353043
48-well Plate	Falcon	353078
1 mL Pipet Tip	USA Scientific	1111-2721
200 µL Pipet Tip	USA Scientific	1111-0706
10 µL Pipet Tip	USA Scientific	1111-3700
5 mL Serological Pipette	SARSTEDT	86.1253.001
10 mL Serological Pipette	SARSTEDT	86.1254.001
25 mL Serological Pipette	SARSTEDT	86.1685.001
50 mL Tube, PP	SARSTEDT	62.547.100
15 mL Tube, PP	SARSTEDT	62.554.100
Culture materials and Reagents
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit	Invitrogen	A16517	Commercial Sendai virus reprogramming kit
Corning hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	Basement membrane matrix
CF1 MEFs, irradiated	ThermoFisher	A34180
DMEM	Sigma-Aldrich	D5671
DMEM/F12	Corning	10-090-CV
αMEM	Corning	10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotec	130-104-368	Commercial iPSC medium
KnockOut DMEM/F-12	ThermoFisher	12660012
FBS Opti-Gold	GenDEPOT	F0900-050
KnockOut Serum Replacement	ThermoFisher	A3181502
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
MEM Nonessential Amino Acids	Corning	25-025-CI
L-Glutamine Solution	Sigma-Aldrich	G7513
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Human FGF-basic (bFGF)	PEPROTECH	100-18B
Recombinant Human PDGF-AB	PEPROTECH	100-00AB
β-Glycerophosphate	Sigma-Aldrich	G9422
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	A4902
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A5960
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS)	Corning	21-031-CV
StemMACS Passaging Solution XF	Miltenyi Biotec	130-104-688	Commercial passaging solution
Accutatse Cell Detachment Solution	Corning	25-058-CI	Cell detachment solution
Thiazovivin (ROCK Inhibitor)	Calbiochem	420220
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Sigma-Aldrich	T4049
Collagenase, Type II	ThermoFisher	17101015
Human NANOG Antibody	R&D System	AF1997
OCT4 Antibody (H-134)	Santa Cruz	sc-9081
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody	R&D System	FAB1435P
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen	DB Biosciences	560123
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	705-545-003
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-545-144
PE Mouse Anti-Human CD105	eBioscience	12-1057-42
FITC Mouse Anti-Human CD44	DB Biosciences	555478
PE Mouse Anti-Human CD73	DB Biosciences	550257
PE Mouse Anti-Human CD166	DB Biosciences	560903
FITC Mouse Anti-Human CD24	DB Biosciences	555427
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Goat Serum	Jackson ImmunoResearch	005-000-121
Alkaline Phosphatase Staining Kit II	Stemgent	00-0055
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich	A5533
TRIzol Reagent	ThermoFisher	15596018
Chloroform	ThermoFisher	C298-500
2-Propanol	ThermoFisher	A416-4
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade	ThermoFisher	BP28184
DNase I, RNase-free (1 U/µL)	ThermoFisher	EN0521
iScript cDNA Synthesis Kit	BioRad	1708891BUN
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	1708884
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free	Corning	354262
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch	DB Biosciences	309597