Isolement de cellules du stroma endométriales humains pour In Vitro décidualisation
Summary
Cette étude présente une procédure validée et optimisée pour l’isolement et la culture de cellules stromales endométriales humaines pour mener l’essai in vitro décidualisation avec. En outre, cette étude fournit une méthode détaillée pour efficacement défiant un gène spécifique à l’aide de siARN dans les cellules du stroma endométriales humains.
Abstract
La différenciation des cellules stromales endomètre humaines (CSEh) de fibroblastes-comme l’aspect en decidua sécrétoire est une transformation nécessaire pour l’implantation de l’embryon dans la muqueuse utérine de l’utérus maternel. Décidualisation incorrecte a été établie comme une cause de racine d’échec d’implantation et ultérieures déni d’embryon précoce. Comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la décidualisation est donc avantageux d’améliorer le taux de naissances avec succès. In vivo études de décidualisation artificielle limitent souvent due à des dilemmes éthiques associées à la recherche humaine, ainsi que des complications translationnelles dans des modèles animaux. Ainsi, des essais in vitro par culture de cellules primaires servent souvent pour explorer la modulation de décidualisation via les hormones. Cette étude fournit un protocole détaillé pour l’isolement des CSEh et ultérieure décidualisation artificielle par l’intermédiaire de la supplémentation d’hormones dans le milieu de culture. En outre, cette étude fournit une méthode bien conçue pour knockdown aucun gène d’intérêt en utilisant la base de lipides siARN transfections. Ce protocole permet l’optimisation de la pureté de la culture mais aussi de rendement produit, maximisant ainsi la possibilité d’utiliser ce modèle comme une méthode fiable pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents décidualisation et la quantification ultérieure des agents sécrétés par les cellules du stroma endométriales decidualized.
Introduction
Entre les étapes de la puberté et la ménopause, les femmes en âge de procréer subissent des cycles mensuels de prolifération endométriale hormone réglementés, différenciation et excrétion ultérieure en vue de la grossesse dans un processus appelé menstruation1 ,2. Ces modifications physiques de l’endomètre humain sont nécessaires pour l’implantation de l’embryon appropriée dans la paroi utérine1. Modifications de l’endomètre, y compris les adaptations morphologiques et biochimiques, sont effectuent tout au long du cycle menstruel par l’intermédiaire des hormones stéroïdes ovariens oestrogène et la progestérone (P4)3,4,5. Dans la phase proliférative (ou folliculaire), œstrogène préovulatoire niveaux augmentation, initiant l’épaississement de l’endomètre. Après l’ovulation, la phase sécrétoire (ou lutéale) favorise une augmentation significative des concentrations de P4, induisant la transformation morphologique des cellules du stroma endométriales (ESC) de fibroblastes-comme l’aspect des arrondis, les cellules épithéliales déciduale dans un processus appelé décidualisation4,6. Décidualisation incorrecte a été établie comme des causes profondes pour échec d’implantation et ultérieures début embryon fausse couche4,7,8. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires qui sous-tendent la décidualisation est avantageuse pour le diagnostic et le traitement de la perte précoce de la grossesse.
Actuellement, plusieurs méthodes sont utilisées pour examiner les effets sous-jacents de décidualisation sur les cellules du stroma endométriales. In vivo, l’utérus de souris peut être induite artificiellement pour décidualisation via une stimulation mécanique (c.-à-d., grattage) ou injection dans un utérus hormonalement apprêtée9d’huile. Distincte de l’homme, cette stimulation synthétique favorise la différenciation de la lumière utérine en offrant l’apparence de la présence de blastocyste, une étape qui est requise pour l’ouverture de décidualisation rongeurs10,11. En conséquence, en raison de complications translationnelles associées à des modèles animaux et les dilemmes éthiques qui entourent en vivo basé des études chez l’homme, modèles de décidualisation basée sont étudiés avec plus de succès in vitro.
Dans cette étude, les sujets sont recrutés par le placement de publicités dans les deux journaux locaux en anglais et en espagnol. Sujets identifiés comme des candidats appropriés pour cette étude sont présentées rencontrer le coordonnateur de la recherche, dans lequel une divulgation complète des risques potentiels sont discutés. Lors de la confirmation d’une compréhension complète des risques potentiels, le consentement des sujets est atteint sous forme écrite et verbale. Consentement du sujet inclut la permission de (1) subissent une phlébotomie (2) durablement de leurs tissus à des fins de recherches futures et (3) d’accord pour la création de cultures primaires d’après des échantillons de tissus prélevés. Après consentement, les sujets reçoivent un formulaire à remplir dans lequel auto-identification permise d’ethnie et/ou le droit de non-divulgation. Une visite ultérieure est prévue pour atteindre la biopsie de l’endomètre basée sur le cycle menstruel du sujet. Volontaires recrutés pour cette étude reflètent les deux la démographie ethnique et raciale de la région métropolitaine de Saint-Louis, répertoriés par le recensement 2012 et n’impliquant pas la participation d’une population vulnérable, y compris les femmes enceintes, les fœtus, les embryons, enfants de moins de 18 ans d’âge, ou d’autres groupes vulnérables. Conditions d’admissibilité à la participation à la collecte d’échantillons de biopsie incluent (1) être âgés de 18 à 45 ans (2) ayant des cycles menstruels réguliers (25 à 32 jours) (3) n’ayant aucun grossesse actuelle ou l’utilisation de contraceptifs hormonaux/intra-utérine périphérique pendant 30 jours précédant l’inscription (4) n’ayant aucun courante infection vaginale ou les maladies sexuellement transmissibles (5) vu aucun traitements antibiotiques actuels et (6) n’ayant aucun courant frottis de Pap.
Dans cette étude, les cellules stromales endométriales humaines (CSEh) sont cultivées et artificiellement induits in vitro la décidualisation par lorsqu’il s’agit d’hormones (estradiol (E2), l’acétate de médroxyprogestérone (MPA) et adénosine cyclique de subir monophosphate cyclique (AMPc)) au milieu. Dans cette méthode, le degré de décidualisation est modifié basée sur le nombre total de jours de traitement hormonal. Parallèlement à la réorganisation du cytosquelette, la supplémentation hormonale induit des adaptations biochimiques dans lequel les cellules déciduale expérience sécrétoire qualités2,4. L’expression des gènes de hallmark, tels que la prolactine (PRL) et la protéine de liaison d’insuline-like growth factor 1 (IGFBP1), peut être utilisée pour confirmer et quantifier le degré de CSEh décidualisation5,12, 13 , 14. ce qui est important, la viabilité de ce protocole pour mener de précipitation spécifique de gène est également démontrée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le cycle menstruel reproducteur féminin se caractérise par une augmentation de la concentration de progestérone pendant la phase lutéale, induisant ainsi la décidualisation de ESC en rond, épithéliales-comme des cellules sécrétrices3,8. L’initiation de décidualisation est espèces dépendantes. Chez l’homme, décidualisation se fait spontanément sur la hausse de la concentration de progestérone, tandis que les souris exigent blastocyste présence<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Materials
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
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