Isolering av Endometrial Stromal menneskeceller for In Vitro Decidualization
Summary
Denne studien presenterer en validert og optimalisert prosedyre for isolasjon og kultur av menneskelige endometrial stromal celler å gjennomføre i vitro decidualization analysen. Videre, denne studien gir en detaljert metode for å effektivt knockdown et bestemt gen bruker siRNAs i menneskeceller endometrial stromal.
Abstract
Differensiering av menneskelige endometrial stromal celler (HESC) fra fibroblast utseende i sekretoriske decidua er en forandring nødvendig for implantasjon av embryoet i livmor lining av mors livmor. Feil decidualization har blitt etablert som en rotårsak for implantasjon svikt og påfølgende tidlig embryo spontanabort. Derfor er forstå molekylære mekanismer underliggende decidualization en fordel å forbedre frekvens vellykket fødsler. I vivo studier av kunstig decidualization er ofte begrenser på grunn etiske dilemmaer knyttet til menneskelige forskning, samt translasjonsforskning komplikasjoner i dyremodeller. Resultatet benyttes i vitro analyser gjennom grunnskolen cellekultur ofte til å utforske modulering av decidualization via hormoner. Denne studien gir en detaljert protokoll for isolering av HESC og påfølgende kunstig decidualization via kosttilskudd av hormoner til culturing medium. Videre, denne studien gir en velutformet metode til knockdown noen genet av interesse ved å benytte lipid-baserte siRNA transfections. Denne protokollen tillater optimalisering av kultur renhet samt produkt avkastning, og dermed maksimere muligheten til å utnytte denne modellen som en pålitelig metode for å forstå molekylære mekanismer underliggende decidualization og den påfølgende kvantifiseringen av utskilles agenter av decidualized endometrial stromal celler.
Introduction
Mellom stadier av menarke og menopause gjennomgå kvinner i reproduktiv alder månedlige sykluser av hormon-regulert endometrial spredning, differensiering og påfølgende blodsutgytelse i forberedelse til graviditet i en prosess som kalles menstruasjon1 ,2. Slike fysiske endringer av menneskelig endometrium er nødvendig for riktig embryoet implantasjon inn i livmor veggen1. Endringer av endometrium, inkludert både morfologiske og biokjemiske tilpasninger, er formidlet gjennom menstruasjonssyklusen via ovarian steroidhormoner østrogen og progesteron (P4)3,4,5. Innenfor den proliferativ (eller follikulær) fasen, preovulatory estrogen nivåer øker, starte endometrium jevning. Etter eggløsning fremmer sekretoriske (eller luteal) fasen en betydelig økning i P4 konsentrasjoner inducing morfologiske transformasjonen av endometrial stromal celler (ESC) fra fibroblast-lignende utseende til avrundet, epithelial-lignende decidual celler i en prosess kjent som decidualization4,6. Feil decidualization har blitt etablert som en rotårsak for implantasjon feil og påfølgende tidlig embryo spontanabort4,7,8. Derfor er forstå molekylære mekanismer underliggende decidualization fordelaktig for diagnostisering og behandling av tidlig graviditet.
For tiden benyttes flere metoder for å utforske underliggende virkningene av decidualization på endometrial stromal celler. I vivo, musen livmoren kan være kunstig indusert for decidualization via mekanisk stimulering (dvs., skrape) eller olje injeksjon i hormonally primet livmoren9. Forskjellig fra mennesker, fremmer dette syntetiske stimulering differensiering av livmor lumen ved å gi utseendet av blastocysten tilstedeværelse, et skritt som kreves for oppstart av decidualization i Red10,11. Følgelig, på grunn av translasjonsforskning komplikasjoner knyttet dyremodeller og etiske dilemmaer rundt i vivo studier i mennesker, er decidualization basert modeller mest vellykket studerte i vitro.
I denne studien er fag rekruttert gjennom plasseringen av annonser i både engelsk og spansk lokalaviser. Emner som egnet kandidater til denne studien er brakt i å møte den koordinatoren, som en full avsløring av potensielle risikoer er omtalt. Idet en fullstendig forståelse av risiko involvert, er fag samtykke oppnådd i både skriftlig og muntlig former. Emnet samtykke inkluderer tillatelse (1) gjennomgå phlebotomy (2) langsiktig lagring av deres vev for fremtidige forskningsformål og (3) samtykke til etableringen av primære kulturer fra samlet vevsprøver. Etter samtykke får fag et skjema fylle ut som tillatt selv-identifikasjon av rase/etnisitet og/eller til høyre for taushetsplikt. Etterfølgende besøk er planlagt å oppnå endometrium biopsi basert på emnet menstrual syklus. Frivillige rekruttert til denne studien reflektere både etniske og rasemessige demografi av St. Louis hovedstadens som dokumentert av folketellingen i 2012 og involverer ikke deltakelse av alle sårbare befolkningen inkludert gravide, fostre, embryo, barn under 18 år, eller andre sårbare grupper. Kravene til deltagelse i samlingen biopsi prøven inkluderer (1) å være i alderen 18-45 år (2) å ha vanlig menstrual sykluser (25-32 dager) (3) har ingen gjeldende graviditet eller bruk av hormonelle/intrauterine enhet piller i 30 dager før registrering (4) ingen gjeldende vaginal infeksjon eller seksuelt overførbare sykdommer (5) har ingen aktuelle antibiotika behandlinger, og (6) har ingen gjeldende unormal Pap smear.
I denne studien er menneskelige endometrial stromal celler (HESC) kultivert og kunstig overtalt til å gjennomgå i vitro decidualization gjennom tilskudd av hormoner (østradiol (E2) medroxyprogesterone acetate (MPA) og syklisk adenosin monofosfat (cAMP)) til mediet. I denne metoden endres graden av decidualization basert på antall dager av hormonell behandling. I forbindelse med cellen cytoskjelett omorganisering induserer hormonelle kosttilskudd biokjemiske tilpasninger som decidual cellene oppleve sekretoriske-lignende egenskaper2,4. Uttrykket av hallmark gener som prolaktin (PRL) og insulin-lignende vekstfaktor bindende protein 1 (IGFBP1), kan brukes til å bekrefte og kvantifisere graden av HESC decidualization5,12, 13 , 14. viktigst, levedyktigheten til denne protokollen å gjennomføre genet bestemt knockdown er også demonstrert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvinnelige reproduktive menstruasjonssyklusen er preget av en økning i progesteronnivåer gjennom luteal fase, og dermed indusere decidualization av ESC i runde, epithelial-lignende sekretoriske celler3,8. Initiering av decidualization er avhengig. Hos mennesker oppstår decidualization spontant på fremveksten av progesteron konsentrasjon, mens mus kreve blastocysten tilstedeværelse10,11. Denne inkonse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ikke avsløre.
Materials
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
