Isolering av mänskliga livmodercancer stromaceller för In Vitro Decidualization
Summary
Denna studie presenterar en validerad och optimerad förfarande för isolering och kultur av mänskliga livmodercancer stromaceller att föra in vitro- decidualization assay. Ytterligare, denna studie ger en detaljerad metod för att effektivt knockdown en specifik gen som använder siRNAs i mänskliga livmodercancer stromaceller.
Abstract
Differentiering av mänskliga livmodercancer stromaceller (HESC) från fibroblast-liknande utseende till sekretoriska decidua är en omvandling som krävs för embryo implantation i livmoderslemhinnan maternell livmoderslemhinnan. Felaktig decidualization har etablerats som en grundorsak för implantation fel och efterföljande tidig embryo missfall. Förstå de molekylära mekanismerna bakom decidualization är därför fördelaktigt att förbättra andelen framgångsrika födslar. In vivo baserade studier av konstgjorda decidualization begränsar ofta på grund av etiska dilemman som är associerad med mänsklig forskning, liksom translationell komplikationer inom djurmodeller. In vitro- analyser genom primär cellkultur används därför ofta för att utforska moduleringen av decidualization via hormoner. Denna studie ger en detaljerad protokoll för isolering av HESC och efterföljande konstgjorda decidualization via komplettering av hormoner till culturing medium. Ytterligare, denna studie ger en väl utformad metod att knockdown någon gen av intresse genom att utnyttja lipid-baserade siRNA transfections. Detta protokoll tillåter optimering av kultur renhet samt produkt avkastning, vilket maximerar möjligheten att använda denna modell som en tillförlitlig metod att förstå de molekylära mekanismerna bakom decidualization och den efterföljande kvantifieringen av utsöndrade ombud av decidualized livmodercancer stromaceller.
Introduction
Mellan stadier av menarche och menopaus genomgår kvinnor i fertil ålder månatliga cykler av hormon-reglerade livmodercancer proliferation, differentiering och efterföljande shedding inför graviditet i en process som kallas menstruation1 ,2. Sådana fysiska ändringar av mänskliga endometriet är nödvändiga för korrekt embryo implantation i livmoderväggen1. Förändringar i endometriet, inklusive både morfologiska och biokemiska anpassningar, förmedlas under hela menstruationscykeln via steroid äggstockshormoner östrogen och progesteron (P4)3,4,5. Inom den proliferativa (eller follikulära) fasen, preovulatory östrogen nivåerna ökar, inleda endometriet förtjockning. Efter ägglossningen främjar den sekretoriska (eller luteala) fasen en betydande ökning i P4 koncentrationer, inducera morfologiska omvandlingen av livmodercancer stromaceller (ESC) från fibroblast-liknande utseende till rundade, epitelial-liknande decidual celler i en process som kallas decidualization4,6. Felaktig decidualization har etablerats som en grundorsak för implantation misslyckande och efterföljande tidig embryo missfall4,7,8. Förstå de molekylära mekanismerna bakom decidualization är därför fördelaktigt att diagnos och behandling av tidiga missfall.
För närvarande används flera metoder för att utforska decidualization underliggande effekter på endometriet stromaceller. In vivo, mus livmodern kan vara artificiellt inducerad för decidualization via mekanisk stimulering (dvs, repor) eller olja injektion i en hormonellt primade livmodern9. Skild från människor, denna syntetiska stimulering främjar differentiering av livmoderns lumen genom uppkomsten av blastocysten närvaro, ett steg som krävs för initiering av decidualization gnagare10,11. Följaktligen på grund av translationell komplikationer i samband med djurmodeller och de etiska dilemman som omger i vivo baserade studier på människor, decidualization baserade modeller studeras mest framgångsrikt in vitro-.
I denna studie rekryteras försökspersoner genom placering av reklam i både engelska och spanska lokaltidningar. Ämnen som identifierats som lämpliga kandidater för denna studie förs in att träffa den forskningskoordinator, där en fullständig redovisning av potentiella risker diskuteras. Vid bekräftelse av en fullständig förståelse av potentiella riskerna uppnås registrerades samtycke i både skriftliga och muntliga former. Angående medgivande omfattar behörigheten att (1) genomgå flebotomi (2) långvarig lagring av sina vävnader för framtida forskningsändamål och (3) samtycka till skapandet av primära kulturer från insamlade vävnadsprover. Efter samtycke ges ämnen ett formulär att fylla i som tillåtna självidentifikation av ras/etnicitet och rätten för yppandeförbud. En efterföljande besök planeras att uppnå endometriet biopsi baserat på motivets menstruationscykeln. Volontärer som rekryteras till denna studie återspeglar både etniska och rasmässiga demografin för regionen metropolitan St Louis som dokumenteras av folkräkningen 2012 och innebar inte någon sårbara befolkningens inklusive gravida kvinnor, foster, embryon, deltagande barn under 18 års ålder eller andra utsatta grupper. Behörighetskrav för deltagande i samlingen biopsi prov omfattar (1) att vara i åldern 18-45 år (2) att ha regelbundna menstruationscykler (25-32 dagar) (3) att ha inga nuvarande graviditet eller användning av hormonella/intrauterin anordning preventivmedel för 30 dagar före inskrivning i studien (4) att ha inga aktuella vaginal infektion eller sexuellt överförbara sjukdomar (5) att ha inga aktuella antibiotika behandlingar, och (6) har inga aktuella onormala cellprov.
Inom denna studie mänskliga livmodercancer stromaceller (HESC) odlade och artificiellt inducerad genomgår in vitro- decidualization genom komplettering av hormoner (estradiol (E2), medroxiprogesteronacetat (MPA) och cykliskt adenosin monofosfat (cAMP)) till medium. I denna metod ändras graden av decidualization baserat på det totala antalet dagar av hormonell behandling. I samband med cytoskeletal ombildning inducerar hormonella tillskott biokemiska anpassningar där de decidual cellerna uppleva sekretoriska-liknande kvaliteter2,4. Uttrycket av hallmark gener, såsom prolaktin (PRL) och insulin-liknande tillväxtfaktor bindande protein 1 (IGFBP1), kan utnyttjas för att bekräfta och kvantifiera graden av HESC decidualization5,12, 13 , 14. allt livskraften hos detta protokoll att föra genen specifika knockdown demonstreras också.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kvinnliga reproduktiva menstruationscykeln kännetecknas av en ökning av progesteronnivåer under lutealfas, därmed förmå decidualization av ESC i runda, epitelial-liknande sekretoriska celler3,8. Inledandet av decidualization är arter som är beroende. Människor uppstår decidualization spontant vid uppkomsten av progesteron koncentration, möss kräver blastocysten närvaro10,11. Denna inkonsekven…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna har något att avslöja.
Materials
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent – CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
