الجيل الأول قلب مثل حقل المتكفل القلب و Cardiomyocytes البطين مثل من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية
Summary
هنا يمكننا وصف أسلوب لتحجيم، استخدام تركيبة بسيطة أضافت أ ووساطة lentivirus Id1-أوفيريكسبريشن، لتوليد أول قلب مثل حقل المتكفل القلب و cardiomyocytes البطين مثل من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية.
Abstract
توليد كميات كبيرة من فروعه القلب المستمدة من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية الفنية وكارديوميوسيتيس من قلب محدد الحقل الأصل هو شرط مسبق لعلاجات أمراض القلب يستند إلى الخلية والنمذجة المرض. وقد أظهرنا مؤخرا أن الجينات معرف ضرورية وكافية لتحديد أول فروعه الميدانية القلب أثناء تطوير الفقاريات. هذا البروتوكول التمايز روافع هذه النتائج ويستخدم Id1 overexpression في تركيبة مع أضافت كرموز تحديد قوية لإنتاج أول قلب مثل حقل (فهف-L) موروث. الأهم من ذلك، تفرق المتكفل الناتجة عن كفاءة (~ 70 – 90%) في cardiomyocytes البطين الشبيهة. هنا يصف لنا طريقة مفصلة 1) توليد هبسكس Id1 overexpressing و 2) التفريق بين كميات قابلة للتطوير كريوبريسيرفابل فهف-L المتكفل و cardiomyocytes البطين مثل.
Introduction
الإنتاج على نطاق كبير من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس)-المتكفل القلب المشتقة و cardiomyocytes هو شرط مسبق للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية1، النمذجة2،3 ، وتوصيف السريع للمرض مسارات جديدة تنظم5،،من4التمايز القلب6 وفسيولوجيا7،8. على الرغم من أن عددا من الدراسات9،،من1011،،من1213،14،15 قد سبق وصف ذات كفاءة عالية بروتوكولات التمايز القلب من هبسكس، أي عالجت أصل الحقل القلب كارديوميوسيتيس الناجمة عن ذلك، وعلى الرغم من تحديد هوية اختلافات الجزيئية بين اليسار (قلب الحقل الأول) والحق (قلب الحقل الثاني) cardiomyocytes البطين16 ووجود القلب الخاصة بمجال أمراض القلب الخلقية؛ أي قلب اليسار التصنع متلازمة17 أو أرهيثموجينيك خلل التنسج البطين الأيمن18. وهكذا، أصبح توليد المتكفل القلب وكارديوميوسيتيس من قلب محدد الحقل الأصل من هبسكس ضروري من أجل زيادة أهميتها باعتبارها العلاجية والمرض أدوات النمذجة.
يعتمد هذا البروتوكول على أوفيريكسبريشن التأسيسي ل Id1، التي تم تحديدها مؤخرا5 أول قلب تحديد حقل جديلة التي في تركيبة مع أضافت، ضروري وكاف لبدء كارديوجينيسيس في هبسكس. جدير بالذكر أن كانينغهام et al. (2017) 5 إظهار أن المتكفل المستحثة Id1 الإعراب على وجه التحديد أول حقل القلب (HCN4، TBX5) لكن الثانية لا قلب الحقل علامات (SIX2، ISL1) فإنها تمر بالتمايز القلب. وباﻹضافة إلى ذلك، الكتاب تظهر أيضا أن وضع الأجنة الماوس المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى أسرة معرف من الجينات (Id1–4)، دون تشكيل أول قلب ميدان القلب موروث، بينما أكثر فروعه القلب الآنسي والخلفي ( يمكن أن لا تزال تشكل قلب الحقل الثاني)، مما يوحي أن معرف البروتينات ضرورية لبدء أول قلب ميدان كارديوجينيسيس في فيفو. مريح، يمكن cryopreserved المستحثة Id1 المتكفل وتفرق عفويا في cardiomyocytes عرض الخصائص الشبيهة بالبطين، بما في ذلك التعبير علامات خاصة بالبطين (IRX4, MYL2) و البطين مثل إمكانات العمل.
هنا يصف لنا طريقة بسيطة وقابلة للتطوير لإنشاء أول قلب مثل حقل (فهف-L) القلب المتكفل و cardiomyocytes البطين مثل من هبسكس overexpressing Id1. من السمات هامة لهذا البروتوكول هو إمكانية فصل الجيل القلب السلف من الإنتاج كارديوميوسيتي اللاحقة باستخدام خطوة تجميد مريحة. باختصار، هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات اللازمة (1) توليد هبسكس Id1 overexpressing، (2) إنشاء فهف-L القلب موروث من هبسكس، (3) كريوبريسيرفي المتكفل الناتجة، و (4) استئناف فهف-L السلف القلب التمايز وتوليد عالي التخصيب (> 70 – 90%) ضرب cardiomyocytes البطين الشبيهة.
Protocol
Representative Results
Discussion
للاختلاف ناجحة، تأكد من اتباع التعليمات المذكورة أعلاه عن كثب. وباﻹضافة إلى ذلك، هنا نسلط الضوء على المعالم الرئيسية التي تؤثر بشدة على نتائج المفاضلة. قبل البدء بتفريق، وينبغي مراعاة المحددات المورفولوجية الثلاثة التالية: مورفولوجيا جذعية من هبسكسId1، ارتفاع ضغط خلوية والتقاء عال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر أعضاء المختبر الكولا لإجراء مناقشات مفيدة وملاحظات حرجة من المخطوطة. وأيد هذه الدراسة بالمعاهد الوطنية للصحة/نيس R44ES023521-02 ومنح سيرم DISC2-10110 للدكتور الكولا.
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
References
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
- Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
- McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , 13 (2012).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
- Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
- Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
- Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).
