Generación del primer corazón campo-como progenitores cardiaca y Ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes
Summary
Aquí describimos un método escalable, con una simple combinación de activina A y mediada por el lentivirus Id1-sobreexpresión, para generar progenitores cardiacos primera de corazón como campo y ventricular como cardiomiocitos desde células madre humanas pluripotentes.
Abstract
La generación de grandes cantidades de progenitores cardiaca derivadas de células madre pluripotentes humanas funcionales y cardiomiocitos de origen de campo de corazón definidos es un requisito previo para celular cardiacas terapias y modelos de enfermedad. Recientemente hemos demostrado que los genes de Id son necesarios y suficientes para especificar los primeros progenitores de campo de corazón durante el desarrollo de vertebrados. Este protocolo de diferenciación aprovecha estos resultados y utiliza Id1 sobreexpresión en combinación con la activina A como potentes señales especifica para producir los primeros progenitores de (FHF-L) de campo como de corazón. Importante, progenitores que resulta distinguen eficientemente (~ 70-90%) en cardiomiocitos ventriculares como. Aquí describimos un método detallado para 1) generar hPSCs overexpressing Id1 y 2) diferenciar cantidades escalables de progenitores de FHF-L cryopreservable y cardiomiocitos ventriculares como.
Introduction
Producción a gran escala de las células madre pluripotent humanas (hPSCs)-derivados progenitores cardíacos y cardiomiocitos es un requisito previo para terapias basadas en células madre1, modelo2,3 y la caracterización rápida de la enfermedad nuevos caminos que regulan diferenciación cardiaca4,5,6 y fisiología7,8. Aunque un número de estudios9,10,11,12,13,14,15 han descrito previamente altamente eficiente protocolos de diferenciación cardiaca de hPSCs, ninguna ha abordado el origen de campo de corazón de cardiomiocitos resultante, a pesar de la identificación de diferencias moleculares entre izquierda (primer campo del corazón) y derecha (segundo campo del corazón) cardiomiocitos ventriculares16 y la existencia de enfermedades cardíacas congénitas corazón campo específico; es decir, corazón izquierdo hipoplásico síndrome17 o arritmogénica displasia ventricular correcta18. Así, la generación de progenitores cardíacos y cardiomiocitos de origen de campo de corazón definidos de hPSCs se está convirtiendo en una necesidad para aumentar su relevancia como terapéuticas y herramientas de modelado de la enfermedad.
Este protocolo se basa en la sobre-expresión constitutiva de Id1, un recientemente identificado5 primer corazón campo especificando localización que en combinación con la activina A, es necesario y suficiente para iniciar la cardiogenesis en hPSCs. En particular, Cunningham et al. (2017) 5 muestran que progenitores Id1-inducida específicamente expresan primer campo del corazón (HCN4, TBX5) pero no segundo marcadores de campo de corazón (SIX2, ISL1) como sufren diferenciación cardiaca. Además, los autores muestran también que desarrollar embriones de ratón transgénico que carece de toda la familia de identificación de los genes (Id1–4), sin formar primer corazón campo cardiaco progenitores, mientras más medial y posterior de progenitores cardíacos ( segundo campo del corazón) puede todavía formar, tal modo sugiriendo que Id proteínas son esenciales para iniciar el primer corazón campo cardiogenesis en vivo. Convenientemente, progenitores Id1-inducida puede ser criopreservados y diferenciarse espontáneamente en cardiomiocitos mostrando ventricular-como características, incluyendo la expresión de marcadores específicos de ventricular (IRX4, MYL2) y ventricular como los potenciales de acción.
Aquí describimos un método simple y escalable para generar primeros progenitores cardiacos (FHF-L) de corazón como campo y cardiomiocitos ventriculares como de hPSCs expresando Id1. Una característica importante de este protocolo es la posibilidad de desacoplar la generación progenitora cardiaca de la producción de cardiomiocitos posterior usando un paso conveniente de criopreservación. En Resumen, este protocolo detalles de las medidas necesarias para (1) generar hPSCs overexpressing Id1, (2) generar progenitores cardiacos FHF-L de hPSCs, (3) progenitores resultantes de criopreservar y (4) reanudar la diferenciación cardiacas progenitoras de FHF-L y generar altamente enriquecido (> 70-90%) superando a cardiomiocitos ventriculares como.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para diferenciaciones exitosas, asegúrese de seguir de cerca las instrucciones mencionadas anteriormente. Además, aquí se destacan los parámetros fundamentales que influyen fuertemente en los resultados de la diferenciación. Antes de iniciar una diferenciación, deben observarse los siguientes tres parámetros morfológicos: una morfología del tallo de hPSCsId1, una alta compactación celular y una confluencia alta (> 90%) de la cultura en el día 0. En ese sentido, mejor se crean condiciones de diferenc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Colas para discusiones útiles y crítica del manuscrito. Este estudio fue apoyado por NIH/NIEHS R44ES023521-02 y CIRM DISC2-10110 otorga al Dr. Colas.
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
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