הדור של אבות לב שדה דמויי הלב הראשון, דמוי-חדרית Cardiomyocytes מתאי גזע Pluripotent אנושי
Summary
כאן נתאר שיטת מדרגיים, באמצעות שילוב פשוט של Activin A ו- Id1 בתיווך lentivirus-ביטוי, כדי ליצור אבות לב שדה דמויי הלב הראשון וחדרית דמוי cardiomyocytes מתאי גזע pluripotent אנושי.
Abstract
הדור של כמויות גדולות של pluripotent האנושי פונקציונלי תאי גזע-derived לב אבות, cardiomyocytes הלב מוגדרים שדה המקור הוא מהווה דרישה מוקדמת עבור טיפולים לב מבוססת תא ומודלים המחלה. אנחנו לאחרונה הראו כי מזהה גנים הדרושים והן מספיקות לציין אבות הראשון של שדה לב במהלך הפיתוח חוליות. פרוטוקול בידול זה ממנף את הממצאים הללו ומשתמש Id1 ביטוי בשילוב עם Activin כמו רמזים ציון חזק כדי לייצר הראשון הלב כמו שדה (FHF-L) אבות. חשוב, וכתוצאה מכך אבות להבדיל ביעילות (~ 70-90%) לתוך cardiomyocytes דמוי חדרית. כאן אנו מתארים שיטה מפורטת ליצירה 1) hPSCs Id1 overexpressing 2) להבדיל כמויות מדרגי של אבות FHF-L cryopreservable חדרית דמוי cardiomyocytes.
Introduction
ייצור בקנה מידה גדול של תאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs)-נגזר לב אבות, cardiomyocytes זה מהווה דרישה מוקדמת עבור טיפולים מבוססי תאי גזע1, מחלת מידול2,3 ואפיון מהירה הרומן משעולים ויסות בידול לב4,5,6 , פיזיולוגיה7,8. למרות מספר מחקרים9,10,11,12,13,14,15 יש שתואר קודם לכן יעיל ביותר פרוטוקולים בידול לב hPSCs, אף אחד לא שלח המקור תחום הלב של cardiomyocytes וכתוצאה מכך, למרות הזיהוי של הבדלים משמעותיים מולקולרי בין שמאל (שדה הלב הראשון) ימינה (שדה הלב השני) cardiomyocytes חדרית16 וקיומו של הלב ספציפיים לשדה מחלות לב מולדים; קרי, שמאלי תסמונת17 או arrhythmogenic דיספלזיה חדרית18. לפיכך, הדור של לב אבות, cardiomyocytes ממוצא שדה מוגדר הלב של hPSCs הופך להיות הכרח כדי להגביר את הרלוונטיות שלהם כמו טיפולית ומחלות כלי מידול.
פרוטוקול זה מסתמך על ביטוי המכונן של Id1, שזוהה לאחרונה5 הראשון לב ציון שדה רמז אשר בשילוב עם Activin A, הן חיוני ומספיק ליזום cardiogenesis ב hPSCs. ראוי לציין, קנינגהם. et al. (2017) 5 מראים כי אבות Id1-induced במיוחד להביע בשדה הלב הראשון (HCN4, TBX5) אבל לא שני סמנים לב שדה (SIX2, ISL1) כפי הם עוברים התמיינות הלב. בנוסף, המחברים גם מראים כי עוברי העכבר הטרנסגניים חסר לכל המשפחה מזהה של גנים (Id1–4), לפתח ללא ויוצרים הראשון הלב שדה לב אבות, בזמן (אבות לב המדיאלי, אחורי נוסף לב השדה השני) יכולים ליצור עדיין, ובכך רומז כי מזהה חלבונים חיוניים ליזום הראשון הלב שדה cardiogenesis ויוו. בנוחות, אבות הנוצרות על-ידי Id1 יכול להיות cryopreserved, להבדיל באופן ספונטני לתוך cardiomyocytes הצגת מאפיינים כמו חדרית, כולל ביטוי סמנים ייחודיים חדרית (IRX4, MYL2), פוטנציאל פעולה כמו חדרית.
כאן אנו מתארים שיטה פשוטה, וניתן להרחבה כדי ליצור הראשון הלב כמו שדה (FHF-L) אבות לב וחדרית דמוי cardiomyocytes מתוך Id1 overexpressing hPSCs. תכונה חשובה של פרוטוקול זה הוא האפשרות לנתק לב דור מייצור cardiomyocyte הבאים באמצעות צעד הקפאה קריוגנית נוח. לסיכום, פרוטוקול זה מפרט את הצעדים הדרושים (1) ליצור hPSCs Id1 overexpressing (2) ליצור את אבות לב FHF-L מ- hPSCs, (3) cryopreserve אבות וכתוצאה מכך, (4) לחדש את הבידול לב FHF-L וצור מאוד מועשר (> 70-90%) להכות cardiomyocytes דמוי חדרית.
Protocol
Representative Results
Discussion
Differentiations מוצלח, ודא לעקוב מקרוב אחר ההוראות המפורטות לעיל. בנוסף, כאן אנחנו מדגישים פרמטרים מרכזיים אשר משפיעים מאוד על תוצאות בידול. לפני שמתחילים הבחנה, להתייחס הפרמטרים הבאים מורפולוגי שלושה: מורפולוגיה גזע של hPSCsId1, דחיסה גבוהה הסלולר ועל זרימה גבוהה (> 90%) של התרבות ביום 0. בהקשר הז…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים חברי המעבדה קולה לדיונים מועיל, ביקורות קריטי של כתב היד. מחקר זה נתמך על ידי NIH/NIEHS R44ES023521-02, CIRM DISC2-10110 מעניקה ד ר קולה.
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
References
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
- Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
- McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , 13 (2012).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
- Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
- Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
- Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).
