最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞およびひと多能性幹細胞からのような心室心筋細胞の生成
Summary
ここで我々 アクチビン A のレンチ ウイルスを介した Id1 を高発現、単純な組み合わせを使用して、ひと多能性幹細胞から最初心臓フィールドのような心臓前駆細胞のような心室心筋細胞を生成するスケーラブルな方法をについて説明します。
Abstract
機能的ひと多能性幹細胞由来心筋前駆細胞の大量および定義された中心領域の原点の心筋細胞の生成は、セルベースの心臓治療法や疾患モデリングの前提です。我々 は最近、Id 遺伝子が必要と脊椎動物の開発中に最初の心臓フィールドの前駆細胞を指定するのに十分なことを示しています。この分化プロトコルは、これらの知見を活用し、最初心臓フィールドのような (急性肝不全-L) 前駆細胞を生成する強力な指定する手がかりとしてアクチビン A との組み合わせで Id1 の過剰発現を使用します。重要なは、結果前駆細胞のような心室心筋細胞 (〜 70-90%) を効率的に区別します。ここで我々 は 1) Id1 過剰発現 hPSCs を生成し、2) 前駆細胞について-L cryopreservable のような心室心筋細胞のスケーラブルな量を区別するための詳細な方法をについて説明します。
Introduction
ひと多能性幹細胞 (hPSCs) の大規模な生産-派生心臓前駆細胞と心筋細胞は幹細胞ベースの治療1、病モデル2,3との迅速な評価の前提新規経路心筋分化4,の5,6と生理7,の8を規制します。,15が非常に効率的な前述した研究9,10、11,12,13,14の数hPSCs から心筋分化誘導方法、どれもが対処にもかかわらず左違いの重要な分子の同定の結果心筋細胞の心臓領域の原点 (最初ハート フィールド) と右の (2 番目のハート フィールド)心室心筋細胞16と心フィールド固有の先天性心疾患の存在すなわち、左心低形成症候群17または不整脈原性右室異形成症18。したがって、心臓前駆細胞の生成と定義されたハート フィールド hPSCs 由来の心筋細胞は治療としての妥当性を高めるために必要になっていると疾患モデリング ツール。
このプロトコルは、Id1、最近同定された5最初ハート フィールドを指定するキュー アクチビン A との組み合わせでは必要であり、hPSCs での心臓を開始するための十分な学会の構成に依存します。特に、カニンガムら(2017)5を示して、Id1 誘起前駆細胞具体的表現 (HCN4、 TBX5) 最初のハート フィールドが 2 番目のないハート フィールド マーカー (SIX2、 ISL1) 心筋分化を遂げる。さらに、著者はまたしたトランスジェニック マウス胚の遺伝子 (Id1–4)、家族Idを欠けている開発最初心臓フィールド心臓前駆細胞より内側と後部の心臓前駆細胞 (間を形成することがなく、表示します。2 つ目のハート フィールド) はそれにより Id 蛋白質初めてハート フィールドの心臓生体内での開始に必須を示唆、まだ形成できます。便利な Id1 誘起前駆細胞凍結保存することができ、自発的に心室固有マーカー (IRX4, MYL2) 式を含め、心室のような特性を表示する心筋細胞に分化し、ような心室の活動電位。
ここで Id1 過剰 hPSCs から最初心臓フィールドのような (急性肝不全-L) 心臓前駆細胞のような心室心筋細胞を生成するシンプルかつスケーラブルな手法について述べる。このプロトコルの重要な機能は、便利な冷凍保存の手順を使用してその後心筋細胞生産から心臓前駆細胞生成を切り離すことです。要約すると、このプロトコルは (1) Id1 過剰発現の hPSCs を生成する、(2) hPSCs から急性肝不全-L 心臓前駆細胞を生成する、(3) 結果前駆細胞の凍結、(4) 再開について L 心臓前駆細胞の分化に必要な手順の詳細し、を生成高濃縮 (> 70-90%) のような心室心筋細胞を打ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
正常な分化、密接に上記の指示に従うことを確認してください。さらに、ここで我々 は強く分化の結果に影響を与える重要なパラメーターを強調表示します。分化を開始する前に次の 3 つの形態学的パラメーターを観察する必要があります: hPSCsId1、高細胞密度および高い合流の幹の形態 (> 90%) 0 日目で文化。その点で最適な分化条件が単一セルとして解離メッキの hPSCsId1に?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は役に立つ議論のコーラのラボのメンバーと原稿の重要なレビューをありがとうございます。本研究は、NIH/NIEHS R44ES023521-02 でサポートされていたし、CIRM DISC2-10110 博士コーラに付与します。
Materials
| ACTC1 antibody | Sigma | A7811 | |
| Activin A | Stem Cell Technologies | Hu Recom Activin A | |
| Antibiotic Antimycotic (Anti-Anti) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement w/o – insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| B27 supplement w/o – vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587001 | |
| CDH5 antibody | R&D Systems | AF938 | |
| CryoStor CS10 | Stem Cell Technologies | 7930 | Cryopreservation reagent |
| DMEM high Glucose | Mediatech | 10-013-CV | |
| DPBS w/ Ca & Mg | Corning | 21-030-CV | |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | |
| FBS | VWR | 89510-186 | |
| FluoVolt membrane potential kit | Thermo Fisher Scientific | F10488 | For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017 |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
| Matrigel, Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Coating reagent |
| mTeSR1 media kit | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| PBS w/o Ca & Mg | Corning | 21-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | ||
| Puromycin | Acros | 227422500 | |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | 5872 | Enzyme-free dissociation reagent |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875-093 | |
| TAGLN antibody | Abcam | ab14106 | |
| Thiazovivin | Stem Cell Technologies | 72254 | RHO/ROCK pathway inhibitor |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605 -010 | 1X enzyme-containing dissociation reagent |
| Tyrodes solution mix packets | Sigma | T2145-10X1L | (For optical action potential acquisition, please refer to McKeithan et al. 2017) |
References
- Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
- Kodo, K., et al. iPSC-derived cardiomyocytes reveal abnormal TGF-beta signalling in left ventricular non-compaction cardiomyopathy. Nature cell biology. 18, 1031-1042 (2016).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494, 105-110 (2013).
- Colas, A. R., et al. Whole-genome microRNA screening identifies let-7 and mir-18 as regulators of germ layer formation during early embryogenesis. Genes & development. 26, 2567-2579 (2012).
- Cunningham, T. J., et al. Id genes are essential for early heart formation. Genes & development. , (2017).
- McKeithan, W. L., Colas, A. R., Bushway, P. J., Ray, S., Mercola, M. Serum-free generation of multipotent mesoderm (Kdr+) progenitor cells in mouse embryonic stem cells for functional genomics screening. Current protocols in stem cell biology. , 13 (2012).
- McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hipsc-derived cardiomyocytes. Frontiers in physiology. 8, 766 (2017).
- Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science translational medicine. 9, (2017).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11, 855-860 (2014).
- Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell stem cell. 8, 228-240 (2011).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1848-1857 (2012).
- Willems, E., et al. Small molecule-mediated TGF-beta type II receptor degradation promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. Cell stem cell. 11, 242-252 (2012).
- Yang, L., et al. Human cardiovascular progenitor cells develop from a KDR+ embryonic-stem-cell-derived population. Nature. 453, 524-528 (2008).
- Palpant, N. J., et al. Generating high-purity cardiac and endothelial derivatives from patterned mesoderm using human pluripotent stem cells. Nature protocols. 12, 15-31 (2017).
- DeLaughter, D. M., et al. Single-cell resolution of temporal gene expression during heart development. Developmental cell. 39, 480-490 (2016).
- Liu, X., et al. The complex genetics of hypoplastic left heart syndrome. Nature genetics. 49, 1152-1159 (2017).
- Corrado, D., Link, M. S., Calkins, H. Arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. New England journal of medicine. 376, 1489-1490 (2017).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Experimental hematology. 31, 1007-1014 (2003).
