إنتاج بروتين الايلاستين مثل الهلاميات المائية للتغليف وإيمونوستينينج من الخلايا في 3D
Summary
المؤتلف الهلاميات المائية هندسة البروتين مفيدة للثقافة خلية ثلاثية الأبعاد كما أنها تسمح لألواح كاملة للعمود الفقري البوليمر، ومن ثم المكروية الخلية. هنا، نحن تصف عملية تنقية المؤتلف الايلاستين مثل البروتين وتطبيقه في تغليف خلية 3D المائية.
Abstract
تقنيات زراعة الأنسجة (2D) ثنائي الأبعاد كانت أساسية لفهمنا لبيولوجيا الخلية الأساسية. ومع ذلك، جمعت الافتقار إلى نظم زراعة الأنسجة 2D التقليدية مصفوفة ثلاثية الأبعاد (3D)، أسفر عن كبير افصل بين النتائج في المختبر و في فيفو. لمعالجة هذا القيد، وقد هندسيا الباحثين منصات زراعة الأنسجة 3D المائية التي يمكن أن تحاكي خصائص المكروية الخلية في فيفو البيوكيميائية والفيزيائية. هذا البحث قد دافع الحاجة إلى تطوير منصات المادية التي تدعم التغليف خلية ثلاثية الأبعاد وفحوصات الكيمياء الحيوية المتلقين للمعلومات. هندسة البروتينات المؤتلف يقدم مجموعة أدوات فريدة من نوعها لتصميم المواد 3D المائية والتنمية عن طريق السماح لعنصر التحكم محددة لتسلسل البروتين، وبالتالي، استطرادا، خصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية المحتملة الناتجة عن ذلك مصفوفة. نقدم هنا، على بروتوكول للتعبير عن مثل الايلاستين المستمدة من ريكومبينانتلي البروتين (ELP)، التي يمكن استخدامها للنموذج الهلاميات المائية مع الخصائص الميكانيكية بشكل مستقل الانضباطي وتركيز يجند خلية لاصقة. كذلك نقدم منهجية لتغليف الخلايا ضمن برنامج القانون البيئي الهلاميات المائية وتلطيخ إيمونوفلوريسسينت اللاحقة لتضمين الخلايا لتحليل المتلقين للمعلومات والقياس الكمي.
Introduction
على مدى القرن الماضي، تطورت زراعة الأنسجة (2D) ثنائي الأبعاد إلى مجموعة أدوات متكاملة لدراسة الخلية الأساسية البيولوجيا في المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، أدت إلى اعتماده البروتوكولات نسبيا منخفضة التكلفة وبسيطة لثقافة الخلية 2D عبر العديد من التخصصات الطبية والبيولوجية. غير أن البحوث أظهرت السابقة أن منصات 2D التقليدية يمكن أن يؤدي إلى نتائج أن تنحرف كثيرا عن تلك التي تم جمعها في فيفو، مما تسبب في وقت ثمين والتمويل إهدار للبحوث سريرياً المنحى1،2، 3. نحن وآخرون افترض أن هذا التناقض يمكن أن يعزى إلى عدم وجود منبهات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية الأصلية المقدمة للخلايا المزروعة في 2D السطوح، التي يمكن أن تكون ضرورية للانتشار الأمثل ونضوج مختلف أنواع الخلايا.
لمعالجة هذه القيود والتعليمات الجسر الفجوة بين 2D بالدراسات في المختبر و في فيفو ، الباحثين المنصات المتقدمة المائية (3D) ثلاثي الأبعاد لتغليف خلية1،4،5 ،6. الهلاميات المائية هي مواد مثالية الخص المكروية الذاتية للمصفوفة خارج الخلية (ECM) في فيفو نظراً للخصائص الميكانيكية مثل الأنسجة وهيكل منتفخة المياه التي تمكن النقل السريع للمواد الغذائية و مما يشير إلى عوامل7،8. وعلاوة على ذلك، يمكن تصميم 3D الهلاميات المائية على السيطرة المستقلة على الخصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية من السقالة. مصفوفة ميكانيكا9،10،،من1112 وخلية لاصقة يغاندس13،،من1415 معروفة جيدا للتأثير على الخلية السلوك في المختبر و في المجراة. وهكذا، الهلاميات المائية 3D مع خصائص الانضباطي منهاجا لدراسة العلاقات السببية بين الخلايا وبهم المكروية. تشمل معايير لمصفوفة مثالية 3D المائية تغليف خلية بسيطة وغير-السامة للخلايا، فضلا عن ألواح مستقلة من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة الخصائص الميكانيكية ويقلد من زخارف لاصقة الخلية الأصلية.
كلا الاصطناعية (مثلاً.، البولي إيثيلين جليكول، حمض اللبنيك، بولي (حمض الجليكوليك)) والمستمدة من الطبيعي (مثلاً.، الجينات، الكولاجين، ماتريجيل) الهلاميات المائية بمزايا على 2D في المختبر منابر الثقافة؛ ومع ذلك، لديهم أيضا أوجه القصور الهامة التي تحد من تطبيقها. الأولى، العديد من منصات الاصطناعية والمستمدة من طبيعة الحال تتطلب الظروف القاسية كروسلينكينج التي يمكن أن تكون محتملة السمية لخلايا الثدييات، مما يؤدي إلى تناقص خلية بقاء7. بالإضافة إلى ذلك، العديد من منصات الاصطناعية تفتقر إلى بيواكتيفيتي الأصلية وتحتاج إلى أن فونكتيوناليزيد عن طريق التفاعلات الكيميائية الثانوية، التي يمكن أن تضيف زيادة تكلفة وتعقيد16. وأخيراً، بينما المواد المستمدة من طبيعة الحال تحتوي عادة على المجالات الحيوية النشطة الجوهرية، أنهم غالباً ما تعاني من ارتفاع دفعة لدفعة تقلب وغالباً ما تقتصر على تشكيل الهلام ضعيفة نسبيا7،17.
هندسة البروتينات المؤتلف ويعرض مجموعة أدوات فريدة من نوعها لتصميم مواد بالسماح بسيطرة واضحة على تسلسل البروتين، واستطراداً، سقالة الخصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية المحتملة للمائية النهائية18. بالإضافة إلى ذلك، بالاستفادة من الآلية البيولوجية المعروفة من الإشريكيّة القولونية (كولاي) للتعبير عن البروتينات، المواد يمكن أن تنتج فعالية من حيث التكلفة واستمرار مع تقلب محدودة في جملة-وداخل-دفعة. إيلاستين-مثل البروتين (ELP) المقدمة هنا بثلاثة مجالات الهندسة: (1) علامة T7 و His6 التي تسمح لوضع العلامات عن طريق فلوريسسينتلي معلم الأجسام المضادة، (2) في منطقة ‘الايلاستين مثل’ أن يمنح مرونة الخواص الميكانيكية ويسمح للمواد الكيميائية كروسلينكينج، و (3) منطقة ‘الحيوية النشطة’ ترميز لزخارف لاصقة الخلية.
يستند منطقتنا مثل الايلاستين المتعارف عليه (فال-برو-الغليسين-إكسا-الغليسين)5 الايلاستين تسلسل فيها أربعة من ‘إكسا’ مواقع من الأحماض الأمينية آيسولوسين (إيل)، ولكن يمكن أن تكون مصممة لتكون الأحماض الأمينية أي استثناء برولين. يمنح هذا التسلسل ELPs المؤتلف مع سلوك أقل درجة الحرارة (لكست) الحل الحاسمة التي يمكن استغلالها للتعبير بعد تنقية بسيطة عبر الحرارية الدراجات19،20. هذه الخاصية لكست يمكن ضبطها لتجميع حرارياً في درجات حرارة مختلفة عن طريق تعديل ضيف ‘إكسا’ بقايا21،22.
هنا، تم استبدال موقف ‘إكسا’ في واحدة من يكرر إيلاستين-مثل خمسة مع الأحماض الأمينية يسين (Lys)-عرض أمين، الذي يستخدم ل crosslinking المائية. وقد أظهرت عملنا السابق crosslinking غير-السامة للخلايا وقوية عن طريق التفاعل مع رد الفعل أمين crosslinker تيتراكيس (هيدروكسيميثيل) فوسفونيوم كلوريد (تهبك)23. متفاوتة عموما البروتين محتوى و crosslinker تركيز، نحن قادرون على إنتاج الهلاميات المائية التي يمكن ضبطها لمدى صلابة صلة فسيولوجيا نطاق (~0.5-50 الجيش الشعبي الكوري)9،23،24. بالإضافة إلى ضبط الخصائص الميكانيكية، خلية التصاق ضمن نتائج المائية من إدماج المتعارف عليه مجالات لاصقة خلية ضمن العمود الفقري للبروتين برنامج القانون البيئي. على سبيل المثال، إدراج تسلسل الأحماض الأمينية ‘رجدس’ فيبرونيكتين-مشتقة موسعة تسمح بالتصاق الخلايا وكونفورماشونال من المرونة، بينما سارعت، المتغير ‘ردجس’ غير ملزم يقيد التصاق الخلية-مصفوفة24. بتحوير نسبة لاصقة الخلية البروتينات غير لاصقة، فضلا عن تركيز البروتين الكلي، نحن قادرون على إنتاج فعالية الهلاميات المائية التي تغطي مجموعة واسعة من تركيز يجند. ريسولتانتلي، قمنا بتطوير منصة المائية مع decoupled الخصائص البيوكيميائية والفيزيائية، والتي يمكن ضبطها بشكل مستقل للثقافة 3D الأمثل لمختلف أنواع الخلايا.
بالإضافة إلى تصلب مصفوفة وألواح يجند لاصقة، المؤتلف الهلاميات المائية توفر القدرة على تصميم التدهور المادي محددة الملامح، وهو أمر ضروري لنشر خلية والانتشار والهجرة ضمن سياق 3D4 , 9-هذا التدهور هو توفرها إفراز الخلية من البروتياز التي تستهدف على وجه التحديد الموسع ‘رجدس’9 أو تسلسل الايلاستين مثل25. الهلاميات المائية ELP أظهرت أيضا دعم فحوصات الكيمياء الحيوية اللاحقة التي ضرورية لدراسة الجدوى الخلية ووظيفة بما في ذلك إيمونوسيتوتشيميستري، فضلا عن استخراج الحمض النووي/رنا/البروتين لعكس الكمية النسخ-البلمرة المتسلسل (قرت-PCR) والغربية لطخة9. كما استخدمت في عدد من النماذج في فيفو متغيرات برنامج القانون البيئي ومعروفة جيدا يسمح ب الجهاز المناعي26.
أخذت معا، تبدأ كمنهاج الدراسات الخلية-تغليف مواد يضم مجموعة واسعة من المزايا مقارنة بمنصات المواد الاصطناعية أو المستمدة من طبيعة الحال، غالباً ما تفتقر إلى نفس الدرجة من ألواح البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية و إمكانية تكرار نتائج. بالإضافة إلى ذلك، بسيطة وغير-السامة للخلايا استخدامها في برنامج القانون البيئي مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا (على سبيل المثال-، خلايا الفرخ الجذرية الظهرية ganglia14،24، السلف العصبية موريني9، والخلايا الجذعية الوسيطة البشرية27، الأبقار تشوندروسيتيس حديثي الولادة28، الإنسان غشائي الخلايا29،30) يسمح لنموذج ذات صلة أكثر من الناحية الفسيولوجية للمحتوى 3D الذاتية مقارنة بثقافة الخلية 2D. هنا، نقدم بروتوكولا للتعبير عن المشتقة من ريكومبينانتلي، ELPs لاستخدامها كمنصة المائية الانضباطي ل 3D الخلية التغليف. كذلك نقدم منهجية تيار أسفل العلامات الفلورية والفحص المجهري [كنفوكل] من الخلايا مغلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعبير البروتين المؤتلف وتنقية أداة قوية لتجميع المواد الحيوية مع إمكانية تكرار نتائج عالية. يرجع ذلك إلى حد كبير إلى ظهور الاستنساخ الجزيئي تجارياً، والبلازميدات المؤتلف مخصصة يمكن شراؤها من عدة موردين، مما يقلل كثيرا من الوقت للعمل مع مواد مثل ELPs. وبالمثل، يمكن طلب والبلازميدات مباشرة ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون “بالمر ت.” ويستخدم أبو حاء (جراحة الأعصاب في جامعة ستانفورد) لتوفير مورين الشخصيات. ناقل الفن في الشكل 4 ومقتبسة من الفن الطبي Servier تحت “الإبداعي العزو 3.0 Unported الترخيص” (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). جزء من هذا العمل قد أنجز في ستانفورد نانو تقاسم مرافق (سنسف)، التي تدعمها “مؤسسة العلوم الوطنية” تحت جائزة ECCS-1542152. تسلم N.A.S. بدعم من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة “المعاهد الوطنية للصحة” (32 جنرال موتورز 008412). وتسلم C.M.M. الدعم من المعاهد الوطنية للصحة الفيدرالية زمالة الدكتوراه قبل (F31 EB020502) و “برنامج الباحثين سيبيل”. تسلم S.C.H. بدعم من المعاهد الوطنية للصحة (AI116484 آسيا تحت 19 عاماً و R21 EB018407) والمؤسسة الوطنية للعلوم (1508006 هيئة الهجرة واللاجئين)، ومعهد كاليفورنيا “الطب التجديدي” (RT3-07948). هذا البحث وتلقى تمويل من التحالف من أجل التجدد التأهيل الأبحاث والتدريب (ع3تي)، الذي يدعمه “يونيس كينيدي شرايفر الوطني معهد صحة الطفل” والتنمية البشرية (NICHD)، المعهد الوطني الاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS)، والمعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية (نيبيب) من المعاهد الوطنية للصحة بموجب قرار التحكيم رقم P2CHD086843. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة آراء “المعاهد الوطنية للصحة”.
Materials
| Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
| 10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
| 0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| 24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
| Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
| Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
| 16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
| Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
| Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
| Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
| Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
| Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
- Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).
- Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
- Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
- Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
- Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
- McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
- McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
- Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
- Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
- Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
- Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
- Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
- Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
- Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
- Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
- Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
- Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
- Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).
