캡슐화 및 3d에서 셀의 Immunostaining에 대 한 엘라 스 틴 같은 단백질 Hydrogels의 생산
Summary
그들은 완전 한 tunability 폴리머 백본 및 따라서 셀 microenvironment의 허용으로 재조합 단백질 엔지니어링 hydrogels는 3D 세포 배양에 대 한 유리한 있습니다. 여기, 우리 재조합 엘라 스 틴 같은 단백질 정화의 과정 및 3 차원 하이드로 겔 셀 캡슐화에의 응용을 설명합니다.
Abstract
2 차원 (2D) 조직 문화 기술 근본적인 세포 생물학의 우리의 이해에 필수적인 되었습니다. 그러나, 전통적인 2D 조직 문화 시스템 부족 결과 사이의 중요 한 결과 3 차원 (3D) 매트릭스 분리 수집 생체 외에서 그리고 vivo에서. 이 한계를 해결 하기 위해 연구자는 vivo에서 세포 microenvironment의 생 화 확 및 생물 속성을 흉내낼 수 있는 3 차원 하이드로 겔 조직 문화 플랫폼 설계 있다. 이 연구는 3D 셀 캡슐화 및 다운스트림 생 화 확 적인 분석 실험을 지 원하는 소재 플랫폼을 개발할 필요가 동기가 있다. 재조합 단백질 공학 단백질 시퀀스의 특정 컨트롤에 대 한 허용 및 따라서, 확장, 결과의 잠재적인 기계 및 생 화 확 적인 속성 3D 하이드로 겔 소재 설계 및 개발에 대 한 고유한 도구 제공 매트릭스입니다. 여기, 우리는 recombinantly 파생 된 엘라 스 틴 같은 단백질 (ELP), 양식 hydrogels 독립적으로 조정할 수 있는 기계적 특성 및 세포 접착 ligand 농도에 사용 될 수 있는 표현에 대 한 프로토콜을 제시. 우리 더 ELP hydrogels 내 셀 캡슐화에 대 한 방법론을 제시 하 고 다운스트림 분석 및 정량화에 대 한 셀을 포함의 후속 immunofluorescent 얼룩.
Introduction
지난 세기 동안 2 차원 (2D) 조직 문화는 근본적인 세포 생물학에서 공부 시험관에대 한 통합 도구 집합으로 개발 했다. 또한, 2 차원 세포 배양에 대 한 상대적으로 저렴 하 고 간단한 프로토콜은 많은 생물학과 의학 분야에 걸쳐 그것의 채용에 이르렀다. 그러나, 과거의 연구 표시 했다 전통적인 2D 플랫폼 이어질 수 있는 결과 그 수집 된 vivo에서에서 현저 하 게 이탈, 귀중 한 시간을 일으키는 원인이 되 고 자금 낭비 임상 지향적인된 연구1,2, 3. 우리와 다른 가설 것이 불일치 최적의 확산 및 다양 한 종류의 세포 성숙에 필요한 수 있는 2D 표면에 경작 하는 셀에 제공 하는 네이티브 생화학 및 생물 단서의 부족에 표시 될 수 있습니다.
이러한 제한 및 도움 다리 2D 간의 격차를 해결 하기 위해 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문, 연구원은 세포 캡슐화1,4,5 개발된 3 차원 (3D) 히드로 플랫폼을가지고 ,6. Hydrogels는 이상적인 재료는 세포 외 기질 (ECM) 생체 내에서 그들의 조직 같은 기계적 성질 및 영양분의 빠른 수송을 가능 하 게 물을 부 어 구조의 내 인 성 microenvironment을 정리 하 고 신호7,8요인. 또한, 3D hydrogels 독립 제어할 발판의 기계 및 생 화 확 적인 속성을 설계할 수 있습니다. 매트릭스 역학9,10,,1112 와 셀 접착제 ligands13,,1415 셀에 영향을 잘 알려져 있습니다. 생체 외에서 행동 하 고 vivo에서. 따라서, 가변 속성 3D hydrogels 셀과 그들의 microenvironment 간의 인과 관계를 연구 하는 플랫폼을 제공 합니다. 이상적인 3D 하이드로 겔 매트릭스에 대 한 기준 간단 하 고, 비 세포 독성 세포 캡슐화로 생리 적으로 관련 된 기계적 특성의 독립적인 tunability 및 기본 세포 접착 모티프의 모방을 포함.
모두 합성 (예., 폴 리 에틸렌 글리콜, polylactic 산, 폴 리 (glycolic acid)) 자연스럽 게 파생 (예., alginate, 콜라겐, Matrigel) hydrogels 있다 이점이 문화 플랫폼 2D 생체 외에서 ; 그러나, 그들은 또한 그들의 적용을 제한 하는 중요 한 단점이 있다. 첫 번째, 포유류 세포에 잠재적으로 독성이 될 수 있는 가혹한 가교 조건을 요구 하는 많은 합성 하 고 자연스럽 게 파생 된 플랫폼, 선도적인 세포 생존7감소. 또한, 많은 합성 플랫폼 네이티브 bioactivity 부족 그리고 증가 비용 및 복잡성16을 추가할 수 있는 보조 화학 반응을 통해 공업화 될 해야 합니다. 마지막으로, 자연스럽 게 파생 된 자료는 일반적으로 내장 바이오 액티브 도메인을 포함, 그들은 종종 높은 일괄 배치 변화를 시달려 고 종종 상대적으로 약한 젤7,17형성에 제한 됩니다.
재조합 단백질 공학 단백질 시퀀스를 명시적으로 제어 함으로써 재료 설계에 대 한 고유한 도구 집합을 제공 하 고, 확장 하 여, 최종 하이드로 겔의 잠재적인 기계 및 생 화 확 적인 재산18발판. 또한, 대장균 (대장균) 단백질을 표현 하의 잘 알려진 생물 학적 기계를 활용 하 여 재료 생산 수 있습니다 효율적이 고 일관 되 게 제한 남북 및 내부-일괄 가변성. 여기에 제시 된 엘라 스 틴 같은 단백질 (ELP)는 3 개의 조작된 도메인: 항 체를 태그를 통해 붙일 라벨을 허용 (1) T7, His6 태그, 수 여 탄성 기계적 성질 및 화학에 대 한 (2)는 ‘ 엘라 스 틴 같은 ‘ 지역 가교, (3) 세포 접착 모티프에 대 한 인코딩 ‘ 바이오-액티브 ‘ 지역.
엘라 스 틴 같은 지역 4 ‘Xaa’ 아미노산 사이트 이소류신 (Ile), 하지만 될 수 있는 어떤 아미노산 프롤린 제외 될 하도록 정식 (발-프로-Gly-Xaa-Gly)5 엘라 스 틴 시퀀스를 기반으로 합니다. 이 시퀀스는 간단한 정화 후 식 열 사이클링19,20를 통해 악용 될 수 있는 낮은 중요 한 솔루션 온도 (LCST) 동작으로 재조합 ELPs endows. 이 LCST 속성 열 집계에 다른 온도에 게스트 ‘Xaa’ 찌 꺼 기21,22를 수정 하 여 조정 될 수 있습니다.
여기, 5 엘라 스 틴 같은 반복 중 하나에 ‘Xaa’ 위치는 아민 제시 리 (리스) 아미노산, 히드로 가교에 이용 되는 대체 되었습니다. 우리의 이전 작품 비 세포 독성과 강력한 아민 반응 crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium 염화 (THPC)23반응을 통해 가교를 보이고 있다. 다양 한 전체 단백질 콘텐츠 및 crosslinker 농도, 우리 hydrogels 순수 관련 강성 범위 (~0.5-50 kPa)9,,2324스팬 조정 될 수 있습니다 생산 수 있습니다. 기계적 성질, 튜닝 외에 히드로 내 세포 접착 ELP 단백질의 백본 내의 정식 셀 접착제 도메인의 통합에서 유래한 다. 예를 들어 비 바인딩 ‘RDGS’ 변종 세포-매트릭스 접착24을 제한 확장된 fibronectin 파생 ‘RGDS’ 아미노산 시퀀스의 세포 접착 및 스크램블, 동안 구조적 유연성을 허용 합니다. 세포 접착 비 접착 단백질 뿐만 아니라 총 단백질 농도의 비율을 변조, 우리가 효과적으로 리간드 농도의 넓은 범위에 걸쳐 hydrogels 생산 수 있습니다. 릴리스할, 히드로 플랫폼 독립적으로 튜닝할 수 없는 다양 한 종류의 세포 최적의 3D 문화에 대 한 분리 된 생 화 확 및 생물 속성을 개발 했습니다.
매트릭스 강성 및 접착제 ligand tunability, 재조합 hydrogels 셀 확산, 확산, 및4 3D 컨텍스트 내에서 마이그레이션에 필요한 디자인 특정 소재 저하 프로필 기능 제공 , 9.이 저하 특히 대상으로 확장된 ‘RGDS’9 또는 엘라 스 틴 같은 시퀀스25프로 테아의 분 비 세포에서 제공. ELP hydrogels 세포 생존 능력 및 기능 immunocytochemistry 양적 역에 대 한 DNA/RNA/단백질 추출 등 공부에 필요한 후속 생 화 확 적인 분석 실험을 지원 하기 위해 표시 되었습니다 또한 전사-연쇄 반응 (qRT-PCR)와 서 부 오9점. ELP 변종 vivo에서 모델의 수에도 사용 되었습니다 그리고26면역 시스템 의해 잘 용납 될 것으로 알려져 있습니다.
합쳐, ELP 다양 한 합성 또는 자연스럽 게 파생 된 소재 플랫폼, 생화학 및 생물 tunability의 동일한 정도 부족에 비해 혜택을 자랑 하는 셀 캡슐화 연구 소재 플랫폼으로 고 재현성입니다. 또한, ELP의 간단 하 고 세포 독성 비 사용 다양 한 세포 유형 (예., 병아리 지 루트 중추14,24, murine 신경 조상 세포9, 인간 간 엽 줄기 세포27, 소 신생아 chondrocytes28, 인간 내 피 세포29,30) 2 차원 세포 배양에 비해 생 3D ECM의 더 순수 관련 모델에 대 한 수 있습니다. 여기, 우리 recombinantly 파생의 표현에 대 한 프로토콜을 제시, 3D에 대 한 가변 히드로 플랫폼으로 사용 하기 위해 ELPs 세포 캡슐화. 우리는 더 다운 스트림 형광 라벨 및 캡슐화 된 세포의 confocal 현미경 검사 법에 대 한 방법론을 제시.
Protocol
Representative Results
Discussion
재조합 형 단백질 표정과 정화 높은 재현성 바이오 소재를 합성 하는 강력한 도구입니다. 때문에 크게 상용화 분자 클로닝의 출현, 사용자 정의 재조합 형 플라스 미드 구입하실 수 있습니다 여러 공급 업체에서 크게 ELPs 같은 재료와 함께 일 하는 시간을 감소 시키는. 마찬가지로, plasmids 원래 작품 연방 계약에 의해 지원 되었다 미래 일 비영리 사용 될 것입니다 때 원래 실험실에서 직접 요청할 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 감사 토니 파머와 H. 간디 (스탠포드 신경외과) 그림 4에서 murine NPCs 벡터 아트를 제공 하는 사용 하 고 크리에이 티브 커먼즈 저작자 표시 3.0 Unported 라이센스 (https://creativecommons.org/ 아래 Servier 의료 예술에서 적용 licenses/by/3.0/legalcode)입니다. 이 작품의 일부에는 스탠포드 나노 공유 시설 (SNSF), 수상 ECCS-1542152에서 국립 과학 재단에 의해 지원 되는 수행 되었다. N.A.S. 지원 국립 과학 연구소에서의 일반 의료 건강의 국가 학회 (32 GM 008412)의 인정합니다. C.M.M. 사전 박사 친목 (F31 EB020502) 그리고 Siebel 학자 프로그램 NIH NRSA에서 지원을 인정 한다. S.C.H. 재생 의학 (RT3-07948)는 건강의 국가 학회 (U19 AI116484 및 R21 EB018407), 국립 과학 재단 (DMR 1508006), 및 캘리포니아 연구소에서 지원을 인정합니다. 이 연구는 유 니스 케네디 슈 라이버 국립 연구소의 아동 건강 및 인간 발달 (NICHD), 국립 연구소에 의해 지원 되는 재생 재활 연구 및 교육 (AR3T), 얼라이언스에서 자금 지원을 받은 신경 성 질환 및 치기 (NINDS), 국립 생물 의학 이미징 및 생명 공학 (NIBIB)의 수상 번호 P2CHD086843에서 건강의 국가 학회. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 의견을 대표 하지 않는다.
Materials
| Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
| 10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
| 0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| 24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
| Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
| Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
| 16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
| Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
| Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
| Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
| Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
| Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
References
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