Productie van elastine-achtige eiwitten Hydrogels voor inkapselen en immunokleuring van cellen in 3D
Summary
Recombinant eiwit-engineered hydrogels zijn voordelig voor 3D-celkweek als ze toe voor volledige tunability van de ruggengraat van het polymeer, en dus de cel communicatie. Hier beschrijven we het proces van recombinante elastine-achtige EiwitReiniging en de toepassing ervan in 3D hydrogel cel inkapseling.
Abstract
Tweedimensionale (2D) weefselkweek technieken zijn essentieel voor ons begrip van de fundamentele celbiologie. Traditionele 2D weefselkweek systemen ontbreken een driedimensionale (3D)-matrix, wat resulteert in een aanzienlijke discrepantie tussen resultaten worden echter verzameld in vitro en in vivo. Om deze beperking, hebben onderzoekers ontworpen 3D hydrogel weefselkweek platforms die de biochemische en biofysische eigenschappen van de cel in vivo communicatie kunnen nabootsen. Dit onderzoek heeft gemotiveerd met de noodzaak te ontwikkelen van materiële platforms die ondersteuning 3D cel inkapselen en downstream biochemische tests. Recombinante Eiwittechnologie biedt een unieke toolset voor 3D hydrogel materiaalontwerp en ontwikkeling doordat voor de specifieke controle van eiwit sequentie en daarom, bij uitbreiding, de potentiële mechanische en biochemische eigenschappen van de resulterende matrix. Hier presenteren we een protocol voor de expressie van recombinantly afkomstige elastine-achtige eiwitten (ELP), die kan worden gebruikt om het formulier hydrogels met onafhankelijk afstembare mechanische eigenschappen en cel-lijm ligand concentratie. Verder presenteren we een methodologie voor de inkapseling van de cel binnen ELP hydrogels en latere immunefluorescentie kleuring van ingesloten cellen voor downstream analyse en kwantificering.
Introduction
In de afgelopen eeuw, tweedimensionale (2D) weefselkweek uitgegroeid tot een integraal toolset voor studeren fundamentele cel biologie in vitro. Bovendien, hebben de relatief goedkope en eenvoudige protocollen voor 2D celkweek geleid tot de goedkeuring ervan in veel biologische en medische disciplines. Afgelopen onderzoek heeft echter aangetoond dat de traditionele 2D platforms tot resultaten leiden kunnen dat afwijken aanmerkelijk van die verzameld in vivo, waardoor kostbare tijd en middelen verspild voor klinisch georiënteerd onderzoek1,2, 3. Wij en anderen veronderstellen dat deze discrepantie kan worden toegeschreven aan het ontbreken van inheemse biochemische en biofysische signalen aan de cellen gekweekt op 2D oppervlakken, die nodig zijn voor de optimale proliferatie en rijping van verschillende celtypes kunnen worden verstrekt.
Om deze beperkingen en help brug de kloof tussen 2D hebben in vitro en in vivo studies, onderzoekers ontwikkelde driedimensionale (3D) hydrogel platforms voor cel-inkapseling1,4,5 ,6. Hydrogels zijn ideale materialen te recapituleren de endogene communicatie van de extracellulaire matrix (ECM) in vivo als gevolg van hun weefsel-achtige mechanische eigenschappen en de water-gezwollen structuur waarmee snelle transport van voedingsstoffen en signalering factoren7,8. Bovendien kan 3D hydrogels worden ontworpen om onafhankelijke controle hebben over de mechanische en biochemische eigenschappen van de steiger. Matrix mechanica9,10,11,12 zowel cel-lijm liganden13,14,15 zijn bekend om te beïnvloeden van de cel gedrag in vitro en in vivo. Dus bieden 3D hydrogels met afstembare eigenschappen een platform om te bestuderen van de causale relaties tussen cellen en hun communicatie. Criteria voor een ideale 3D hydrogel matrix omvatten eenvoudige, niet-cytotoxische cel-inkapseling, alsmede onafhankelijke tunability van fysiologisch relevante mechanische eigenschappen en nabootsers van inheemse cel-lijm motieven.
Beide synthetische (bv., Polyethyleenglycol, polylactic acid, poly (glycolic zuur)) en natuurlijk afkomstige (bv., alginaat, collageen, Matrigel) hydrogels hebben voordelen ten opzichte van 2D in vitro cultuur platformen; echter, ze hebben ook aanzienlijke tekortkomingen waardoor hun toepasbaarheid beperkt. Eerste, vele synthetische en natuurlijk afkomstige platformen vereist harde crosslinking voorwaarden die potentieel giftig voor de cellen van zoogdieren kunnen, wat leidt tot verminderde cel levensvatbaarheid7. Bovendien, vele synthetische platformen gebrek aan inheemse topicale en moeten worden matiemaatschappij via secundaire chemische reacties, die meer kosten en complexiteit16kunnen toevoegen. Tot slot, terwijl natuurlijk afkomstige materialen doorgaans intrinsieke bio-actieve domeinen bevatten, ze worden vaak geplaagd door hoge-charges-variabiliteit en zijn vaak beperkt tot de vorming van relatief zwakke gels7,17.
Recombinante Eiwittechnologie presenteert een unieke toolset voor materialen ontwerp doordat expliciete controle over eiwit sequentie en, bij uitbreiding, de potentiële mechanische en biochemische eigenschappen van de definitieve hydrogel steigerwerk18. Bovendien, door gebruik te maken van de bekende biologische machines van Escherichia coli (E. coli) uitspreken eiwitten, kunnen materialen worden geproduceerd rendabel en consequent met beperkte inter – en intra-batch variabiliteit. De elastine-achtige eiwitten (ELP) hier gepresenteerd heeft drie gemanipuleerde domeinen: (1) een T7 en His6 tag waarmee voor labeling via fluorescently gelabeld antilichamen, (2) een ‘elastine-like’-regio die verleent elastische mechanische eigenschappen en zorgt voor chemische crosslinking, en (3) een ‘bio-active’-gebied dat voor cel-lijm motieven codeert.
Onze regio elastine-achtige is gebaseerd op de canonieke (Val-Pro-Glycine-Xaa-Glycine)5 elastine sequentie waar vier van de ‘Xaa’ aminozuur sites zijn isoleucine (Ile), maar kunnen worden ontworpen om elk aminozuur behalve proline. Deze reeks schenkt recombinante ELPs met lagere temperatuur (LCST) gedrag van kritische oplossing die kan worden benut voor eenvoudige reiniging na expressie via thermische fietsen19,20. Deze eigenschap van de LCST kan worden afgestemd op thermisch statistische bij verschillende temperaturen door aanpassing van de gast ‘Xaa’ residu21,22.
De positie van de ‘Xaa’ op één van de vijf elastine-achtige herhalingen is hier, met de amine-presenteren lysine (Lys) aminozuur, die wordt gebruikt voor de hydrogel crosslinking vervangen. Onze vorige werk is gebleken niet-cytotoxische en robuuste crosslinking via reactie met de amine-reactieve crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) fosfonium chloride (THPC)23. Door verschillende algemene inhoud en crosslinker eiwitconcentratie kunnen we produceren hydrogels die kunnen worden afgestemd om te beslaan een fysiologisch relevante stijfheid bereik (~0.5-50 kPa)9,23,24. Naast tuning mechanische eigenschappen, cel adhesie binnen de hydrogel vloeit voort uit de integratie van canonieke cel-lijm domeinen binnen de ruggengraat van de ELP-eiwit. Bijvoorbeeld, de opneming van de uitgebreide fibronectine afkomstige ‘RGDS’ aminozuur sequentie zorgt voor cel adhesie en conformationele flexibiliteit, terwijl de gecodeerde, niet-bindende ‘RDGS’ variant cel-matrix hechting24beperkt. Door het moduleren van de verhouding van cel-lijm niet-klevende eiwitten, evenals de totale eiwitconcentratie, kunnen we effectief produceren hydrogels die een grote verscheidenheid aan ligand concentratie bestrijken. Resultantly, hebben we een hydrogel platform met ontkoppelde biochemische en biofysische eigenschappen, die onafhankelijk van elkaar kunnen worden afgestemd voor optimale 3D cultuur van verschillende celtypes.
Naast de matrix stijfheid en zelfklevende ligand tunability bieden recombinante hydrogels de mogelijkheid om ontwerp specifieke materiële achteruitgang profielen, die nodig voor het verspreiden van cel proliferatie en migratie binnen een 3D-kader4 is , 9. deze afbraak wordt geboden door cel secretie van proteasen die specifiek gericht zijn op de uitgebreide ‘RGDS’9 of elastine-achtige reeks25. ELP hydrogels is ook gebleken dat ter ondersteuning van de latere biochemische tests die nodig zijn voor het bestuderen van de levensvatbaarheid van de cellen en de functie met inbegrip immunocytochemie evenals DNA/RNA/eiwit extractie voor kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase-kettingreactie (qRT-PCR) en Western blot9. ELP varianten zijn ook gebruikt in een aantal in vivo modellen en is bekend dat ze goed worden verdragen door het immuunsysteem26.
Tezamen, ELP zoals een materiële platform voor cel-inkapseling studies beschikt over een breed scala aan voordelen ten opzichte van synthetisch of natuurlijk afgeleide materiaal platforms, die vaak niet dezelfde mate van biochemische en biofysische tunability en reproduceerbaarheid. Bovendien, ELP van eenvoudig en niet-cytotoxische gebruik met een breed scala aan celtypes (bv., chick dorsal root ganglia14,24, lymfkliertest neurale progenitor cells9, menselijke mesenchymale stamcellen cellen27, runderen neonatale chondrocyten28, mens endotheliale cellen29,30) zorgt voor een meer fysiologisch relevante model voor de endogene 3D ECM in vergelijking met 2D celkweek. Hierin presenteren we een protocol voor de expressie van het recombinantly-afgeleide, ELPs voor het gebruik als een afstembare hydrogel platform voor 3D cel inkapseling. Verder presenteren we de methodologie voor het stroomafwaarts fluorescerende benoemen en confocale microscopie van ingekapselde cellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recombinant eiwit expressie en zuivering is een krachtig hulpmiddel voor het synthetiseren van biomaterialen met hoge reproduceerbaarheid. Als gevolg van grotendeels de komst van gecommercialiseerde moleculaire klonen, kunnen aangepaste recombinante plasmiden worden gekocht bij verschillende leveranciers, die aanzienlijk vermindert de tijd om te werken met materialen zoals ELPs. Evenzo, plasmiden kunnen aangevraagd worden rechtstreeks vanuit de oorspronkelijke lab als het originele werk werd ondersteund door een federaal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken T. Palmer en H. Babu (Stanford Neurochirurgie) voor het verstrekken van lymfkliertest NPCs. Vector kunst in Figuur 4 werd gebruikt en aangepast van clientverzoeken medische kunst onder Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Onderdeel van dit werk werd uitgevoerd op de Stanford Nano gedeelde faciliteiten (SNSF), ondersteund door de National Science Foundation onder award ECCS-1542152. N.A.S. erkent dat ondersteuning van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. erkent steun van een NRSA NIH-gepromoveerde fellowship (F31 EB020502) en het Siebel-programma voor academici. S.C.H. erkent ondersteund door de National Institutes of Health (U19 AI116484 en R21 EB018407), National Science Foundation (DMR-1508006), en het California Institute voor regeneratieve geneeskunde (RT3-07948). Dit onderzoek financiering ontvangen van de Alliantie voor regeneratieve Rehabilitation Research & Training (AR3T), die wordt ondersteund door de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health en de menselijke ontwikkeling (NICHD), National Institute of Neurologische stoornissen en Stroke (NINDS) en National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) van de National Institutes of Health onder nummer P2CHD086843 Award. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs, en niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
| 10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
| 0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| 24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
| Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
| Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
| 16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
| Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
| Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
| Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
| Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
| Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
References
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
- Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).
- Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
- Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
- Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
- Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
- Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
- Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
- McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
- McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
- Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
- Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
- Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
- Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
- Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
- Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
- Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
- Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
- Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
- Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
- Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
- Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).
