Produção de elastina, como proteína hidrogel para encapsulamento e imunocoloração de células em 3D
Summary
Hidrogel engenharia de proteínas recombinantes é vantajosos para cultura celular 3D, já que permitem completo pré-definido a espinha dorsal do polímero e, portanto, o microambiente celular. Aqui, descrevemos o processo de purificação de proteínas recombinantes de elastina, como e sua aplicação no encapsulamento de célula de hidrogel 3D.
Abstract
Bidimensional (2D) cultura do tecido técnicas têm sido essenciais para o nosso entendimento da biologia das células fundamentais. No entanto, a falta de sistemas de cultura de tecido tradicional 2D uma matriz tridimensional de (3D), resultando em um significativo desconexão entre resultados coletados in vitro e in vivo. Para resolver essa limitação, os pesquisadores têm engenharia plataformas de cultura de tecidos de hidrogel 3D que podem imitar as propriedades bioquímicas e biofísicas do microambiente celular na vivo . Esta pesquisa tem motivado a necessidade de desenvolver materiais plataformas que oferecem suporte a 3D celular encapsulamento e ensaios bioquímicos a jusante. Engenharia de proteínas recombinantes oferece um único conjunto de ferramentas para design material de hidrogel 3D e desenvolvimento, permitindo o controle específico da sequência da proteína e, portanto, por extensão, as propriedades mecânicas e bioquímicas potenciais a resultante matriz. Aqui, apresentamos um protocolo para a expressão de recombinantes derivados como elastina proteína (ELP), que pode ser usado de forma hidrogel com propriedades mecânicas independentemente ajustáveis e concentração de ligante de célula-adesivo. Ainda mais, apresentamos uma metodologia para encapsulamento de célula dentro de hidrogel ELP e coloração imunofluorescente subsequentes de embutidos células para análise a jusante e quantificação.
Introduction
Durante o século passado, cultura de tecidos bidimensional (2D) desenvolveu-se em um conjunto de ferramentas integral para estudar a célula fundamental biologia em vitro. Além disso, os protocolos relativamente barata e simples para cultura de células 2D conduziram a sua adopção em muitas disciplinas biológicas e médicas. No entanto, passado pesquisa tem mostrado que as plataformas 2D tradicionais podem levar a resultados que desviam acentuadamente aqueles recolhidos na vivo, causando o tempo precioso e financiamento desperdiçaram para pesquisa clinicamente orientada1,2, 3. Nós e os outros a hipótese que esta discrepância pode ser atribuída à falta de pistas de bioquímicas e biofísicas nativas fornecido para as células cultivadas em superfícies 2D, que podem ser necessárias para ideal proliferação e maturação dos vários tipos de células.
Para resolver essas limitações e ajuda ponte a lacuna entre 2D estudos in vitro e in vivo , os pesquisadores têm desenvolvido tridimensional (3D) hidrogel plataformas para celular-encapsulamento1,4,5 ,6. Hidrogel é materiais ideais para recapitular o microambiente endógeno da matriz extracelular (ECM) na vivo devido a suas propriedades mecânicas, como tecido e água-inchada estrutura que permite o transporte rápido de nutrientes e sinalização de fatores7,8. Além disso, 3D hidrogel pode ser projetado para ter controle independente sobre as propriedades mecânicas e bioquímicas do cadafalso. Tanto matriz mecânica9,10,11,12 e célula-adesivo ligantes13,14,15 são bem conhecidos para influenciar a célula comportamento em vitro e in vivo. Assim, 3D hidrogel com propriedades ajustáveis oferece uma plataforma para estudar as relações causais entre as células e seu microambiente. Critérios para uma matriz de hidrogel 3D ideal incluem simples, não citotóxicas célula-encapsulamento bem como pré-definido independente das propriedades mecânicas fisiologicamente relevantes e imita de motivos de célula-adesivo nativos.
Ambos sintético (EG., polietilenoglicol, ácido polilático, poli (ácido glicólico)) e naturalmente derivados (ex., alginato, colágeno, Matrigel) hidrogel têm vantagens sobre 2D em vitro plataformas de cultura; no entanto, eles também têm deficiências significativas que limitam a sua aplicabilidade. Primeiro, muitas plataformas sintéticas e naturalmente derivados exigem reticulação duras condições que podem ser potencialmente tóxicas para as células dos mamíferos, levando à diminuição de viabilidade celular7. Além disso, muitas plataformas sintéticas faltam Bioatividade nativa e precisam ser acrescida através de reações químicas secundárias, que podem adicionar o aumento de custo e complexidade16. Finalmente, enquanto materiais naturalmente derivados normalmente contêm domínios de bio-ativos intrínsecos, eles muitas vezes são atormentados pela alta variabilidade para lotes e muitas vezes limitam-se à formação de géis relativamente fraco7,17.
Engenharia de proteína recombinante apresenta um único conjunto de ferramentas para design de materiais, permitindo o controle explícito sobre a sequência da proteína e, por extensão, as propriedades mecânicas e bioquímicas potenciais de hidrogel o final do andaime18. Além disso, aproveitando as máquinas biológicas conhecidas de Escherichia coli (e. coli) que expressam proteínas, materiais podem ser produzidos a custos reduzidos e consistentemente com variabilidade limitada intere intralote. A elastina, como proteína (ELP) apresentada aqui tem três domínios de engenharia: (1) uma tag T7 e His6 que permite através de rotulagem fluorescente etiquetado anticorpos, (2) uma região ‘elastina-like’ que confere propriedades mecânicas elásticas e permite a química reticulação e (3) uma região ‘bio-ativos’ que codifica para celular-adesivo motivos.
Nossa região de elastina, como se baseia a sequência canônica de elastina5 (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly) onde quatro do ‘Xaa’ sites de aminoácidos são isoleucina (Ile), mas podem ser projetado para ser qualquer aminoácido excepto prolina. Esta sequência dota ELPs recombinantes com comportamento de temperatura (LCST) solução crítica inferior que pode ser explorada para pós-expressão de purificação simples via térmica ciclismo19,20. Esta propriedade LCST pode ser ajustada para termicamente agregadas em diferentes temperaturas, modificando os comentários ‘Xaa’ resíduo21,22.
Aqui, a posição de ‘Xaa’ em uma das cinco repetições elastina-como foi substituída com o amina-apresentando lisina (Lys) aminoácido, que é utilizado para reticulação de hidrogel. Nosso trabalho anterior demonstrou não citotóxicas e robusto ligando via reação com a amina reativos crosslinker tetrakis (hidroximetil) do phosphonium cloreto (THPC)23. Pela variação total concentração da proteína conteúdo e agente reticulante, somos capazes de produzir hidrogel que pode ser ajustados para abranger uma rigidez fisiologicamente relevantes gama (~0.5-50 kPa)9,23,24. Além do ajuste de propriedades mecânicas, aderência de célula dentro o hidrogel resulta da integração dos domínios de célula-adesivo canônicas dentro a espinha dorsal da proteína ELP. Por exemplo, a incorporação da sequência de aminoácidos de ‘RGDS’ derivado de fibronectina estendida permite a aderência de célula e flexibilidade conformacional, enquanto os ovos mexidos, variante de ‘RDGS’ não-vinculativa restringe de adesão célula-matriz24. Modulando a proporção de células-adesivo para proteínas não adesivas, bem como a concentração de proteínas totais, somos capazes de produzir efetivamente hidrogel que abrangem uma vasta gama de concentração de ligante. Resultantly, desenvolvemos uma plataforma de hidrogel com propriedades bioquímicas e biofísicas dissociadas, que pode ser ajustado independentemente para cultura 3D ideal de vários tipos de células.
Além de matriz de rigidez e pré-definido de ligante adesivo, hidrogel recombinante oferece a capacidade de perfis de degradação material específico do projeto, que é necessária para a célula se espalhando, proliferação e migração dentro de um contexto 3D4 , 9. esta degradação é conferida pela secreção da célula de proteases que visam especificamente o estendido ‘RGDS’9 ou sequência elastina25. Hidrogel ELP também foram mostrados para suportar os ensaios bioquímicos subsequentes que são necessários para o estudo de viabilidade celular e função incluindo imunocitoquímica, bem como a extração de DNA/RNA/proteína para reversa quantitativa reação em cadeia da polimerase-transcrição (qRT-PCR) e Western blot-9. Variantes do ELP também têm sido usadas em um número de modelos na vivo e são conhecidas por ser bem tolerada pelo sistema imunológico26.
Tomados em conjunto, ELP como uma plataforma de material para estudos de célula-encapsulamento possui uma ampla variedade de benefícios em comparação com plataformas materiais sintéticas ou natural-derivado, que muitas vezes não têm o mesmo grau de bioquímico e biofísico pré-definido e reprodutibilidade. Além disso, não citotóxicas uma do ELP utilização simples e com uma grande variedade de tipos de células (por exemplo., garota raiz dorsal gânglio14,24, murino progenitoras neurais células9, tronco mesenquimal humano células27, bovinos condrócitos neonatal28, humanos endoteliais células29,30) permite a um modelo mais fisiologicamente relevante de ECM 3D endógena em comparação com a cultura de pilha 2D. Neste documento, apresentamos um protocolo para a expressão de recombinantes derivados, encapsulamento de células ELPs para o uso como uma plataforma de hidrogel ajustáveis para 3D. Ainda mais, apresentamos a metodologia para a rotulagem fluorescente de jusante e microscopia confocal de células encapsuladas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Purificação e expressão da proteína recombinante é uma ferramenta poderosa para sintetizar biomateriais com alta reprodutibilidade. Devido em grande parte para o advento da clonagem molecular comercializado, plasmídeo recombinante personalizado pode ser adquirido de vários fornecedores, que reduz significativamente o tempo para trabalhar com materiais como o ELPs. Da mesma forma, plasmídeos podem ser solicitados diretamente do laboratório de origem, quando o trabalho original foi apoiado por um contrato federal …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecer T. Palmer e H. Barbosa (Stanford neurocirurgia) para fornecer murino NPCs. vetoriais na Figura 4 foi utilizada e adaptada da arte médica Servier sob licença Creative Commons Attribution 3.0 Unported (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Parte deste trabalho foi realizada no Stanford Nano compartilhado instalações (SNSF), apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob prémio ECCS-1542152. N.A.S. reconhece o apoio do Instituto Nacional de General Medical Ciências, do National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. reconhece apoio de um NRSA NIH doutorandos fellowship (F31 EB020502) e o programa de estudiosos do Siebel. S.C.H. reconhece apoio do National Institutes of Health (AI116484 de Sub-19 e R21 EB018407), National Science Foundation (DMR-1508006) e o Instituto de Califórnia para a medicina regenerativa (RT3-07948). Esta pesquisa recebeu financiamento da Aliança para pesquisa de reabilitação regenerativa & treinamento (AR3T), que é apoiada pela Eunice Kennedy Shriver National Institute de saúde infantil e desenvolvimento humano (FORMULADORES), Instituto Nacional de Distúrbios neurológicos e Stroke (NINDS) e do Instituto Nacional de imagem biomédica e bioengenharia (NIBIB) dos institutos nacionais de saúde, sob número P2CHD086843 Award. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões do institutos nacionais da saúde.
Materials
| Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
| 10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
| 0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| 24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
| Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
| Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
| 16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
| Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
| Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
| Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
| Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
| Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
References
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