Produzione di elastina-come proteina idrogeli per incapsulamento e Immunostaining delle cellule in 3D
Summary
Idrogeli di ingegneria della proteina ricombinanti sono vantaggiosi per la coltura cellulare 3D poiché consentono completa accordabilità della catena polimerica e di conseguenza, il microambiente delle cellule. Qui, descriviamo il processo di purificazione della proteina ricombinante elastino-simili e la sua applicazione in incapsulamento cella 3D idrogel.
Abstract
Tecniche di coltura tissutale (2D) bidimensionali sono stati essenziali per la nostra comprensione della biologia delle cellule fondamentali. Tuttavia, la mancanza di sistemi di coltura del tessuto 2D tradizionale una matrice tridimensionale (3D), risultante in un significativo scollamento tra risultati raccolti in vitro e in vivo. Per risolvere questa limitazione, i ricercatori hanno creato piattaforme di coltura del tessuto 3D idrogel che possono imitare le proprietà biochimiche e biofisiche del microambiente delle cellule in vivo . Questa ricerca ha motivato la necessità di sviluppare materiale piattaforme che supportano incapsulamento cella 3D e analisi biochimiche a valle. Ingegneria delle proteine ricombinanti offre un unico set di strumenti per disegno materiale idrogel 3D e sviluppo, consentendo il controllo specifico di sequenza della proteina e quindi, per estensione, le potenziali proprietà meccaniche e biochimiche della risultante matrice. Qui, presentiamo un protocollo per l’espressione di recombinantly-elastina-come proteina derivata (ELP), che può essere utilizzato per forma idrogel con proprietà meccaniche regolabili in modo indipendente e concentrazione del ligando delle cellule-adesivo. Presentiamo inoltre una metodologia per l’incapsulamento di cellule all’interno di ELP idrogeli e macchiatura immunofluorescente successive di embedded cellule per analisi a valle e la quantificazione.
Introduction
Durante il secolo passato, coltura del tessuto bidimensionale (2D) è sviluppato in un set di strumenti integrato per lo studio della biologia fondamentale delle cellule in vitro. Inoltre, i protocolli relativamente basso costo e semplici per la coltura cellulare 2D hanno condotto alla sua adozione attraverso molte discipline biologiche e mediche. Tuttavia, ricerca passata ha dimostrato che le tradizionali piattaforme 2D possono portare a risultati che si discostano sensibilmente da quelli raccolti in vivo, causando tempo prezioso e finanziamenti sprecati per ricerca clinicamente orientata1,2, 3. Noi ed altri suppongono che questa discrepanza può essere attribuita alla mancanza di nativi biochimiche e biofisiche spunti forniti per le cellule coltivate su superfici 2D, che possono essere necessarie per la proliferazione ottimale e maturazione dei vari tipi di cellule.
Per risolvere queste limitazioni e aiuto ponte il divario tra 2D in vitro e in vivo gli studi, i ricercatori hanno sviluppato idrogel tridimensionale (3D) piattaforme per cellulari-incapsulamento1,4,5 ,6. Idrogeli sono materiali ideali per ricapitolare il microambiente endogeno della matrice extracellulare (ECM) in vivo a causa di loro proprietà meccaniche del tessuto-come e struttura gonfio d’acqua che consente il rapido trasporto di nutrienti e segnalazione fattori7,8. Inoltre, idrogeli 3D possono essere progettati per avere controllo indipendente sulle proprietà meccaniche e biochimiche dell’impalcatura. Sia matrice meccanica9,10,11,12 e ligandi cellulari-adesivo13,14,15 sono ben noti per influenzare la cella comportamento in vitro e in vivo. Così, idrogeli 3D con proprietà sintonizzabile offrono una piattaforma per studiare le relazioni causali tra cellule e loro microambiente. Criteri per una matrice di idrogel 3D ideale includono semplice, non citotossica delle cellule-incapsulamento come pure accordabilità indipendente di proprietà meccaniche fisiologicamente rilevanti e mimici di nativi cella-adesivo motivi.
Entrambi sintetico (ad es., polietilenglicole, acido polilattico, poli (acido glicolico)) e di derivazione naturale (ad es., alginato, collagene, Matrigel) idrogeli presentano vantaggi rispetto 2D in vitro piattaforme di cultura; Tuttavia, essi hanno anche notevoli lacune che limitano la loro applicabilità. Primo, molte piattaforme di derivazione naturale e sintetiche richiedono condizioni di reticolazione duro che possono essere potenzialmente tossiche per le cellule di mammiferi, che porta alla diminuzione di attuabilità delle cellule7. Inoltre, molte piattaforme sintetici mancano nativa bioattività e bisogno di essere funzionalizzate attraverso reazioni chimiche secondarie, che possono aggiungere maggiore costo e complessità16. Infine, mentre materiali di derivazione naturale contengono tipicamente intrinseche bio-attivi domini, essi sono spesso afflitti da un’elevata variabilità lotto e spesso sono limitate a formare gel relativamente debole7,17.
Ingegneria delle proteine ricombinanti presenta un unico set di strumenti per la progettazione di materiali consentendo controllo esplicito sulla sequenza della proteina e, per estensione, le potenziali proprietà meccaniche e biochimiche dell’idrogel finale dell’impalcatura18. Inoltre, sfruttando il ben nota macchine biologiche di Escherichia coli (Escherichia coli) per esprimere proteine, materiali possono essere prodotto in modo conveniente e coerente con la variabilità limitata inter – e intra-batch. La proteina elastina-come (ELP) presentata qui ha tre domini ingegnerizzati: (1) un tag T7 e His6 che consente per etichettatura tramite fluorescente contrassegnati gli anticorpi, (2) una regione ‘elastin-like’ che conferisce proprietà meccaniche elastiche e consente per l’industria chimica reticolazione e (3) una regione ‘bio-attivi’ che codifica per motivi di cella-adesivo.
Nostra regione di elastina-come si basa sulla canonica sequenza di elastina (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 dove quattro dei ‘Xaa’ siti dell’amminoacido isoleucina (Ile), ma potrebbero essere progettato per essere qualsiasi amminoacido ad eccezione della prolina. Questa sequenza dota ricombinante ELPs con comportamento di temperatura (LCST) soluzione critica inferiore che può essere sfruttata per post-l’espressione purificazione semplice via19,20di cicli termici. Questa proprietà LCST può essere sintonizzata per termicamente aggregato a temperature diverse modificando l’ospite ‘Xaa’ residuo21,22.
Qui, la posizione di ‘Xaa’ su una delle cinque ripetizioni elastina-come è stata sostituita con la presentazione di ammina lisina (Lys) dell’aminoacido, che è utilizzata per la reticolazione di idrogel. Il nostro lavoro precedente ha indicato non citotossica e robusto reticolazione tramite reazione con l’ammina-reattivo crosslinker tetrachis (idrossimetil) fosfonio cloruro (THPC)23. Di varie proteine contenuti e crosslinker concentrazione complessiva, siamo in grado di produrre idrogel che può essere sintonizzato per estendersi su una rigidità fisiologicamente rilevanti gamma (~0.5-50 kPa)9,23,24. Oltre alle proprietà meccaniche di tuning, cellula adesione all’interno dei risultati di idrogel dall’integrazione dei domini canonici di cella-adesivo all’interno la spina dorsale della proteina ELP. Ad esempio, l’incorporazione di estesa fibronectin-derivato ‘RGDS’ sequenza dell’amminoacido permette delle cellule adesione e flessibilità conformazionale, mentre le uova strapazzate, variante di ‘RDGS’ non vincolante limita di adesione cellula-matrice24. Modulando il rapporto di cella-adesivo non adesivo proteine come pure la concentrazione nella proteina totale, siamo in grado di produrre in modo efficace gli idrogel che abbracciano una vasta gamma di concentrazione del ligando. Resultantly, abbiamo sviluppato una piattaforma di idrogel con proprietà biochimiche e biofisiche disaccoppiate, che può essere regolato in modo indipendente per coltura ottima 3D di vari tipi cellulari.
Oltre alla matrice di rigidezza e accordabilità legante adesivo, ricombinante idrogel offrono la possibilità di profili di degrado del materiale specifico design, che è necessaria per la diffusione delle cellule, la proliferazione e la migrazione all’interno di un contesto 3D4 , 9. questo degrado è garantito dalla secrezione delle cellule delle proteasi che si rivolgono specificamente elastina-come sequenza25o estesa ‘RGDS’9 . ELP idrogeli inoltre sono stati indicati per sostenere le successive analisi biochimiche che sono necessari per lo studio di attuabilità delle cellule e la funzione compreso immunocytochemistry così come estrazione di DNA/RNA/proteine per inversione quantitativa reazione a catena della polimerasi della trascrizione (qRT-PCR) e Western blot9. ELP varianti inoltre sono stati usati in un certo numero di modelli in vivo e sono noti per essere tollerato dal sistema immunitario26.
Presi insieme, ELP come una piattaforma di materiale per gli studi delle cellule-incapsulamento vanta una vasta gamma di vantaggi rispetto alle piattaforme di materiale sintetiche o di derivazione naturale, che spesso non hanno lo stesso grado di accordabilità biochimiche e biofisiche e riproducibilità. Inoltre, non citotossica un di ELP uso semplice e con un’ampia varietà di tipi cellulari (ad es., pulcino radice dorsale dei gangli14,24, progenitrici neurali murini cellule9, cellule staminali mesenchimali umane27, bovino condrociti neonatale28, human endothelial cells29,30) consente per un modello più fisiologicamente rilevante del ECM 3D endogeno rispetto alla coltura delle cellule 2D. Qui, presentiamo un protocollo per l’espressione di recombinantly-derivati, ELPs per l’uso come una piattaforma di idrogel sintonizzabile per 3D cell incapsulamento. Vi presentiamo ulteriormente la metodologia per l’etichettatura fluorescente downstream e microscopia confocale delle cellule incapsulate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Purificazione ed espressione recombinant della proteina è un potente strumento per sintetizzare biomateriali con elevata riproducibilità. A causa dell’avvento della clonazione molecolare commercializzato in gran parte, plasmidi ricombinanti personalizzati possono essere acquistati da diversi fornitori, che riduce significativamente il tempo di lavorare con materiali come ELPs. Allo stesso modo, plasmidi possono essere richiesti direttamente dal laboratorio di origine quando l’opera originale è stata sostenuta da un co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano T. Palmer e H. Basile (Stanford neurochirurgia) per la fornitura di murino NPC. Vector art nella Figura 4 è stato usato e adattato da Servier arte medica sotto Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Parte di questo lavoro è stato effettuato presso la Stanford Nano ha condiviso strutture (FNS), sostenuto dalla National Science Foundation sotto Premio ECCS-1542152. N.a.s. riconosce sostegno dal National Institute of General Medical Sciences, della National Institutes of Health (32GM 008412). C.m.m. riconosce il supporto da un NRSA NIH pre-dottorato (F31 EB020502) e il programma di studiosi di Siebel. S.C.H riconosce sostegno dal National Institutes of Health (U19 AI116484 ed EB018407 R21), National Science Foundation (DMR 1508006) e il California Institute for Regenerative Medicine (RT3-07948). Questa ricerca ha ricevuto finanziamenti dall’alleanza rigenerativa riabilitazione Research & Training (AR3T), che è sostenuta dalla Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e Human Development (NICHD), Istituto nazionale di Disordini neurologici e colpo (NINDS) e Istituto nazionale di Imaging biomedico e Bioingegneria (NIBIB) degli istituti nazionali di salute sotto Premio numero P2CHD086843. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni del National Institutes of Health.
Materials
| Elastin-Like Protein Expression and Purification | |||
| 10 cm Petri Dishes | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 70% Ethanol | RICCA Chemical | 2546.70-1 | |
| Ammonium Sulfate | Sigma-Aldrich | A3920-500G | |
| Ampicillin | Thermo Fisher Scientific | BP1760-25G | |
| Bacto Agar | Thermo Fisher Scientific | 9002-18-0 | |
| BL21(DE3)pLysS Competent Cells | Invitrogen | C606003 | |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| EDTA disodium salt, dihydrate | Thermo Fisher Scientific | O2793-500 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Isopropanol | Thermo Fisher Scientific | A451-4 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Thermo Fisher Scientific | BP1755-10G | |
| Luria Broth | EMD Millipore | 1.10285.5007 | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | MP Biomedicals | 195381 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S 8045-1KG | |
| Syringe Filter Unit (0.22 μm) | Millipore | SLGP033RB | |
| Terrific Broth | Millipore | 71754-4 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels | |||
| 0.22 μm syringe filters | Millipore | SLGV004SL | |
| 0.5 mm thick silicone sheet | Electron Microscopy Science | 70338-05 | |
| 24-well tissue culture plates | Corning | 353047 | |
| Disposable Biopsy Punch (2 mm) | Integra Miltex | 33-31 | |
| Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Integra Miltex | 33-34 | |
| Disposable Biopsy Punch (5 mm) | Integra Miltex | 33-35 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CM | |
| No. 1 12 mm glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) | Sigma-Aldrich | 404861-100ML | |
| 0.5% Tryspin/EDTA | Thermo Fisher | 15400054 | |
| Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels | |||
| 16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Roche | 3116956001 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Molecular Probes | D1306 | |
| Donkey Serum | Lampire Biological Labs | 7332100 | |
| Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) | Molecular Probes | A-11017 | |
| Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) | Molecular Probes | A-11071 | |
| Goat Serum | Gibco | 16210-072 | |
| Mouse Nestin Primary Antibody | BD Pharmingen | 556309 | |
| Mouse Sox2 Primary Antibody | Cell Signaling Technology | 23064S | |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Vectashield Hardset Mounting Medium | Vector Labs | H-1400 |
References
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