Ganganalyse altersabhängigen motorische Beeinträchtigungen bei Mäusen mit neurodegenerativen Erkrankungen
Summary
In dieser Studie zeigen wir Ihnen die Nutzung der kinematischen Ganganalyse anhand der ventralen Flugzeug imaging zu überwachen, die subtilen Veränderungen in motorische Koordination sowie das Fortschreiten der Neurodegeneration mit zunehmendem Alter in Maus-Modellen (z. B. Endophilin mutant Mauslinien).
Abstract
Motor Verhalten Tests sind häufig verwendet, um die funktionelle Relevanz eines Nagetier Modells ermitteln und testen neu entwickelte Behandlungen in diesen Tieren. Kann insbesondere Ganganalyse Recapture Krankheit, relevanten Phänotypen, die bei menschlichen Patienten, insbesondere bei neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet werden, die motorische Fähigkeiten wie Parkinson-Krankheit (PD), Alzheimer-Krankheit (AD), Amyotrophe beeinflussen Lateralsklerose (ALS) und andere. In frühen Studien entlang dieser Linie, die Messung der gangartparameter war umständlich und abhängig von Faktoren, die schwer zu kontrollieren waren (z. B. Laufgeschwindigkeit, Dauerbetrieb). Die Entwicklung der ventralen Flugzeug Bildsysteme (VPI) machte es möglich, Ganganalyse in großem Maßstab, so dass diese Methode ein nützliches Werkzeug für die Beurteilung der motorischen Verhalten bei Nagetieren führen. Hier präsentieren wir Ihnen eine ausführliche Protokoll wie kinematische Ganganalyse verwendet, um den altersabhängigen Verlauf der motorischen Defizite in Mausmodellen der Neurodegeneration zu prüfen; Maus mit verringerte Niveaus des Endophilin, in denen neurodegenerativen Schäden nach und nach mit dem Alter steigt, als Vorbild dienen.
Introduction
Neurodegenerative Erkrankungen eine erhebliche Belastung für Patienten, Familien und Gesellschaft zu verhängen, und werden noch besorgniserregender als die Lebenserwartung steigt, und die Weltbevölkerung wächst weiter, Alter. Eines der häufigsten Symptome von neurodegenerativen Erkrankungen sind Balance und Mobilität Probleme. So, Charakterisierung der motorischen Verhalten im Altern Säugetieren (z. B. Nagetier) Modelle und/oder Modelle zeigen Neurodegenerative Phänotypen, ist ein wertvolles Werkzeug zu zeigen, die in Vivo -Bedeutung von den bestimmten tierischen Modelle oder therapeutische Behandlungen, die darauf abzielen, die Krankheitssymptome zu verbessern. Fast jeder Ansatz zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen erfordert letztlich in einem Tiermodell vor Beginn einer klinischen Prüfung am Menschen getestet. Daher ist es wichtig, zuverlässige, reproduzierbare Verhalten Tests haben, die konsequent quantifizieren krankheitsrelevante Phänotypen entlang alter Fortschreiten, um sicherzustellen, dass ein Kandidat-Medikament, das Potenzial in einem in Vitro -Modell zeigte, kann verwendet werden den Phänotyp in ein lebendes Tier effektiv zu verbessern.
Ein Aspekt der motorischen Verhalten Beurteilung bei Nagetieren ist kinematische Ganganalyse, die von VPI (auch genannt ventrale Flugzeug Videografie)1,2ausgeführt werden können. Diese bewährte Methode nutzt die kontinuierliche Aufnahme von der Unterseite der Nagetiere zu Fuß auf eine transparente und motorisiertes Laufband Gürtel1,2,3,4. Analyse des Videos Datenfeed erzeugt “digitale pfotenabdrücken” von allen vier Gliedmaßen, die dynamisch und zuverlässig das Nagetier Gangbild, als ursprünglich von Kale Et Al. beschrieben rekapitulieren 2 und Amende Et al. 3.
Das Prinzip der Imaging-basierte Ganganalyse ist um die Pfote Fläche in Kontakt mit dem Laufband Gürtel im Laufe der Zeit für jeden einzelnen Pfote zu messen. Jede Haltung wird durch eine Erhöhung der Pfote Bereich (in der Bremsphase) und eine Abnahme der Pfote Bereich (in der Antriebs-Phase) dargestellt. Darauf folgt der Schwungphase in dem kein Signal erkannt wird. Schwung- und Standphase zusammen bilden eine Schrittlänge. Neben gangartparameter Dynamik können Körperhaltung Parameter auch die aufgenommenen Videos entnommen werden. Vorbildliche Parameter und deren Definition sind in Tabelle 1 aufgeführten und gehören Haltung Breite (SW; der kombinierten Abstand von der vorderen oder hinteren Pfoten auf die Schnauze-Tail-Achse), Länge (SL; durchschnittliche Entfernung zwischen zwei Schritte von der gleichen Pfote) schreiten oder Pfote Platzierung Winkel (der Winkel von der Pfote auf die Schnauze-Tail-Achse). Die Körperhaltung und Gangart Dynamik Daten ermöglichen Schlussfolgerungen auf tierische Balance (durch Körperhaltung Parameter und ihre Variabilität über mehrere Stufen) und Koordination (von Dynamik gangartparameter). Andere Parameter, wie z. B. Ataxie-Koeffizient (SL Variabilität berechnet, indem [(Max.) SL−min. SL) bedeuten SL /]), Hind Gliedmaßen Haltung (Zeit, die beide Hinterbeine in Kontakt mit dem Gürtel sind), geteilt oder Pfote ziehen (Gesamtfläche von der Pfote auf den Riemen aus volle Haltung, Lift-Off Pfote) auch extrahiert werden können, und berichtet in verschiedenen neurodegenerativen di geändert werden zu5,6,7,8 -Modelle (siehe Tabelle 1).
| Parameter | Einheit | Definition |
| Angriffszeit | MS | Dauer der Zeit ist die Pfote nicht in Kontakt mit den Riemen |
| Haltung-Zeit | MS | Dauer der Zeit, die die Pfote in Kontakt mit dem Gürtel ist |
| % Bremse | % der Haltung Zeit | Prozentsatz der Haltung Zeit sind die Pfoten in die Bremse-phase |
| % zu treiben | % der Haltung Zeit | Prozentsatz der Haltung Zeit sind die Pfoten in der Antriebs-phase |
| Haltung-Breite | cm | kombinierte Abstand zwischen der vorderen oder hinteren Pfoten und Schnauze-Tail-Achse |
| Schrittlänge | cm | durchschnittliche Entfernung zwischen zwei Schritte von der gleichen Pfote |
| Schrittfrequenz | Schritte/s | Anzahl der vollständigen Schritte pro Sekunde |
| Pfote Platzierung Winkel | DEG | Winkel von der Pfote in Bezug auf die Schnauze-Tail-Achse des Tieres |
| Ataxie-Koeffizient | a.u | SL-Variabilität von [(max SL-min SL)/Mittelwert berechnet SL] |
| % gemeinsame Haltung | % der Haltung | Hind Gliedmaßen gemeinsame Haltung Zeit; Zeit, die beide Hinterbeine gleichzeitig in Kontakt mit dem Gürtel sind |
| Pfote ziehen | mm2 | Gesamtfläche von der Pfote auf den Riemen aus volle Haltung, Lift-Off Pfote |
| Extremität be- | cm2 | MAX dA/dT; maximale Änderungsrate der Pfote Bereich in der Bruch-phase |
| Schritt Winkel Variabilität | DEG | Standardabweichung des Winkels zwischen den hinteren Pfoten als Funktion der SL und SW |
Tabelle 1. Definition der wichtigsten gangartparameter, die durch ventrale Flugzeug Bildgebung getestet werden können.
Beurteilung der motorischen Verhaltens der Nager-Modelle für Neurodegenerative Erkrankungen kann abhängig von der Schwere des Phänotyps eines bestimmten Modells in einem bestimmten Alter schwierig sein. Mehrere Krankheiten, vor allem PD zeigen starke motor Verhalten (Fortbewegung) Defizite, sowohl bei Patienten als auch in Tiermodellen. Eines der vier wichtigsten Symptome bei Morbus Parkinson ist Bradykinesie, die mit dem Altern fortschreitet und manifestiert sich in schweren Gang Beeinträchtigungen bereits in frühen Stadien der PD9. Studien über die akute PD Modell, Nagetiere mit 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) behandelt wurden bereits VPI Gangart Analyse10,11,12eingesetzt. Jedoch sprechen angesichts der akuten Art dieses Modells, diese Studien die altersbedingte Fortschreiten der motorischen Defizite nicht. Mehrere Studien haben Ganganalyse bei gealterten Mäusen mit Neurodegenerative Veränderungen, zum Beispiel13,14,15, betont die Relevanz des Verständnisses der Progression der Erkrankung mit zunehmendem Alter durchgeführt. .
Neben motorischen Defizite Tiermodelle neurodegenerativer Erkrankungen oft haben Schwierigkeiten mit Schwerpunkt auf die Prüfungsaufgaben und prominente kognitive Beeinträchtigungen, insbesondere mit zunehmendem Alter zeigen. Solch ein Phänotyp beeinflussen das Ergebnis von Tests der motorischen Verhalten. Eines der am häufigsten verwendeten Tests zu prüfen, motorische Defizite, die Rotarod Test16, hängt nämlich, Wahrnehmung, Aufmerksamkeit und Stress17,18. Während die Bereitschaft, sich auf ein motorisiertes Laufband gehen auch von diesen Faktoren abhängt, die aufgezeichneten Auslesen läuft, die zeichnet sich mehr standardisiert und weit weniger durch veränderte Wahrnehmung beeinflusst. Auswirkungen von Stress und Aufmerksamkeit möglicherweise in bestimmten Parametern, wie Swing/Haltung Zeit für Stress und SL für Aufmerksamkeit19,20, aber nicht im laufenden Gesamtergebnis sichtbar.
Des kinematischen Gangart Analyseansatzes weiter bietet den Vorteil, dass Optionen zum Anpassen der Herausforderung für Nager-Modelle. Das Laufband mit einstellbarer Winkel und die Geschwindigkeit ermöglicht es wenige Geschwindigkeiten von 0,1 – 99,9 cm/s, so dass Nagetiere mit schweren Beeinträchtigungen zu Fuß noch mit langsamer Geschwindigkeit ausgeführt werden können (~ 10 cm/s). Nicht beeinträchtigte Tiere auf schnelleres laufen Geschwindigkeiten gemessen werden (30 – 40 cm/s). Die Beobachtung der unabhängig davon, ob die getesteten Tiere mit einer bestimmten Geschwindigkeit ausführen können liefert ein Ergebnis von selbst. Darüber hinaus kann der Nager zusätzlich eine Steigung oder unten einen Rückgang durch das Laufband in einem gewünschten Winkel mit Hilfe eines goniometers kippen oder durch Anhängen einen gewichteten Schlitten an Maus oder Ratte Hinterbeine laufen angefochten werden.
Neben zahlreichen Studien der einzelnen Proteine, die bei Patienten mutiert sind, ist eine aktuelle Sensibilisierung der Verbindungen zwischen defekten Endozytose Prozess- und Neurodegeneration13,21,22, 23,24,25,26,27,28. Maus-Modelle mit verringerte Niveaus des Endophilin-A (nunmehr Endophilin), ein wichtiger Akteur in beiden Clathrin-vermittelte Endozytose13,21,29,30,31 , 32 , 33 , 45 und Clathrin-unabhängige Endozytose34, erwiesen sich als Neurodegeneration und altersabhängigen Beeinträchtigungen im motorischen Aktivität13,21zeigen. Drei Gene kodieren die Familie von Proteinen, Endophilin: Endophilin 1, Endophilin 2, und 3 Endophilin. Vor allem der Phänotyp infolge Erschöpfung der Endophilin Proteine variiert stark abhängig von der Anzahl der fehlenden Endophilin Gene13,21. Während triple Knock Out (KO) aller Endophilin Gene tödlich nur wenige Stunden nach der Geburt und Mäuse ohne beide Endophilin 1 und 2 nicht gedeihen und innerhalb von 3 Wochen nach der Geburt sterben ist, zeigt einzelne KO für eines der drei Endophilins keine offensichtlichen Phänotyp für getestet Bedingungen-21. Andere Endophilin mutierte Genotypen zeigen geringere Lebensdauer und motorische Beeinträchtigungen mit zunehmendem Alter13zu entwickeln. Z. B. Endophilin 1KO 2HT 3KO Mäuse Anzeige zu Fuß Veränderungen und feinmotorische Koordinationsprobleme (wie durch kinematische Ganganalyse und Rotarod getestet) bereits nach 3 Monaten des Alters, während ihren wurfgeschwistern zeigen Endophilin 1KO 2WT 3KO Tiere eine signifikante Rückgang der motorischen Koordination nur auf 15 Monate alter13. Aufgrund der großen Vielfalt der Phänotypen in diesen Modellen ist es notwendig zu erkennen und anwenden ein Tests, das eine Vielzahl von Herausforderungen, die das Tier Motor und Kognition Fähigkeiten sowie dem Alter entsprechend integrieren können. Hier zeigen wir die experimentellen Verfahren, die auf die kinematische Ganganalyse zur Bewertung der Entstehung und Progression von motorischen Beeinträchtigungen in einem Mausmodell, die Neurodegenerative Veränderungen (z. B. Endophilin Mutanten) zeigt. Dazu gehören die Messung gangartparameter bei verschiedenen Alters und unterschiedlicher Schweregrade der Fortbewegung Beeinträchtigungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die motorische Koordination zu studieren, ist ein sinnvoller Ansatz in der Charakterisierung der Modelle von neurodegenerativen Erkrankungen, vor allem für Krankheiten wie PD in denen motorische Koordination stark betroffen ist. Mit Hilfe eines kinematischen Gangart Analyse funktionelle Assays identifizieren wir subtile Veränderungen in den Gang der Tiere bei Beginn der Fortbewegung Probleme oder Modelle mit schwachen Neurodegeneration und daher relativ bescheidenen Phänotyp. Angesichts der breiten Palette der Phänot…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Tierpfleger bei der ENI Tierhaus für Hilfe bei der Zucht und Dr. Nuno Raimundo für nützliche Kommentare auf das Manuskript. I.m. wird unterstützt durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) durch den Sonderforschungsbereich SFB-889 (Projekt A8) und SFB-1190 (Projekt P02) und Emmy Noether Young Investigator Award (1702/1). C.M.R. wird durch das Stipendium von der Göttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und Biophysik, Molekulare Biowissenschaften (GGNB) unterstützt.
Materials
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA | DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware | |
| non-transparent blanket or dark cloth | cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress | ||
| balance | e.g. Satorius | balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g | |
| red finger paint | e.g. Kreul or Staedtler | for increasing the contrast between paws and animal’s body | |
| small paint brush | soft brush to apply finger paint to the animal paws | ||
| diluted detergent | for cleaning | ||
| disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol | e.g. B.Braun | for desinfection |
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