神経変性疾患を持つマウスの年齢依存性運動障害の歩行分析
Summary
本研究で我々 は腹面が加齢マウス モデル (例えば、エンドフィリン突然変異体の神経変性の進行と同様、モーターの調整の微妙な変化を監視するイメージングに基づく運動歩行解析の使用方法を示すマウスの行)。
Abstract
モーターの動作テストは齧歯動物モデルの機能的関連性を決定するために使用されますが、新しくをテストするこれらの動物の治療法を開発しました。具体的には、歩行解析により再収集病、筋萎縮性側アルツハイマー病 (AD)、パーキンソン病 (PD) など運動能力に影響を与える神経変性疾患を中心に、人間の患者で観察される関連する表現型外側硬化症 (ALS)、および他。この線に沿った初期の研究で歩行パラメーターの測定は骨の折れるとコントロールしにくい要因に依存して (例えば、走行速度、連続運転)。腹面イメージング (VPI) システムの開発では、齧歯動物でこのメソッドの運動行動の評価のための便利なツールを作って、大規模な歩行分析を実行することは不可能。ここでは、提案する神経変性; のマウス ・ モデルにおける運動障害の年齢依存進行を調べる運動学的歩行分析を使用する方法の詳細なプロトコルエンドフィリン、変性損傷が徐々 に年齢とともに増加の低下レベルでのマウスの行は例として使用されます。
Introduction
神経変性疾患の患者・家族・社会に深刻な負担を課すこと、平均寿命が上がるにつれて、関心が大きくなるし、世界の人口でエージングを続けます。神経変性疾患の最も一般的な症状の一つはバランスと機動性の問題です。したがって、特性 (例えば、齧歯動物) の哺乳類の老化運動行動のモデル、またはモデルの神経変性の表現型を示すが生体内で関連性を示す特定の動物モデルまたは治療する貴重なツール病気の症状を改善することを目指して治療します。神経変性疾患の治療にほぼすべてのアプローチは最終的に人間の臨床試験の開始前に動物モデルでのテストが必要です。したがって、一貫して年齢の進行に沿って病に関連した表現型を定量化するための in vitroモデルの可能性を示した、候補薬ができるようにするために使用できる信頼性の高い、再現可能な動作テストすることが重要です。生きている動物の表現型を効果的に改善します。
齧歯動物の運動行動評価の 1 つの側面は、VPI (また呼ばれる腹面ビデオ撮影)1,2で行うことができる運動歩行分析です。透明およびモーターを備えられたトレッドミル ベルト1,2,3,4の頂上に歩いて齧歯動物の下側の連続記録この確立されたメソッドを使用します。ビデオ フィード データの解析が動的にかつ確実に要約齧歯動物の歩行パターンでは、もともとケールらで定義されているすべての 4 つの手足の「デジタル足プリント」を作成します2 Amendeら3。
イメージングに基づく歩行分析の原則は、それぞれの個々 の足の時間をかけてトレッドミル ベルトと接触して手領域を測定することです。すべての姿勢は、足エリア (ブレーキの段階では) で、(推進中) 足の面積の減少の増加によって表されます。これは、信号が検出されない遊脚相が続きます。スイングやスタンス一緒にストライドを形成します。歩行ダイナミクスのパラメーターに加え、姿勢パラメーターは、記録したビデオから抽出できます。模範的なパラメーターと定義の表 1に掲げるとスタンス幅 (SW; 前部または後部足から吻尾軸までの複合距離) を含む、歩幅 (SL; 同じ足の 2 つの前進間の平均距離)、または足の配置角度 (吻尾軸に足の角度)。姿勢と歩行の動態データを許可 (姿勢パラメーターと複数のステップ変動) による動物のバランスと (歩行力学パラメーター) によって調整に関する結論を引き出す。運動失調係数 (SL 変動 [(最大で計算など、その他のパラメーターSL−min。SL) 意味する SL/])、後肢共有スタンス時間 (両後肢がベルトに接触している時間) または足ドラッグ (リフトオフの手による姿勢からベルトに足の総面積) も抽出することができます、様々 な神経変性 · ディ · 変更する報告されています。病モデル5,6,7,8 (表 1参照)。
| パラメーター | ユニット | 定義 |
| スイング ・ タイム | ms | 足はベルトとの接触時間の期間 |
| 立ち時間 | ms | 足はベルトとの接触時間 |
| % ブレーキ | 立ち時間の % | 姿勢の時間足、ブレーキの段階の割合 |
| % を推進します。 | 立ち時間の % | 足は、推進段階スタンス時間の割合 |
| スタンス幅 | cm | 前部または後部足から吻尾軸までの距離合計 |
| ストライドの長さ | cm | 同じ足の 2 つの前進間の平均距離 |
| ストライド | 前進/s | 1 秒あたりの完全な大またの数 |
| 足の配置角度 | 度 | 動物の吻尾軸に関連して足の角度 |
| 運動失調の係数 | a.u. | SL [(max SL-min SL)/平均によって計算された SL 変動] |
| % 共有姿勢 | スタンスの % | 後肢共有姿勢の時間;両後肢が同時にベルトと接触している時間 |
| 足ドラッグ | mm2 | リフトオフの手による姿勢からベルトに足の総面積 |
| 肢荷重 | cm2 | 最大ダ/dT;速報段階では足の変化の最大レート |
| ステップ角度変動 | 度 | 後肢の間の角度の標準偏差は、SL と SW の関数として足します。 |
表 1。腹面イメージングによってテストすることができますキー歩行パラメーターの定義。
神経変性疾患モデルマウスの運動行動の評価は与えられた年齢での特定のモデルの表現型の重症度に応じて挑戦することができます。いくつか病気、最も目立つように PD を強力なモーター動作 (歩行) 赤字は、患者と動物モデルの両方。PD の 4 つの主症状の一つは加齢とともに進行し、PD9の初期の段階で既に重度の歩行障害のマニフェスト運動緩慢です。急性の PD モデル 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) が奏効の齧歯動物の研究は既に VPI 歩行分析10、11,12を使用しています。しかし、このモデルの急性の性質を考えると、これらの研究は対処できません加齢に伴う運動障害の進行。いくつかの最近の研究はたとえば13,14,15, 加齢とともに病気の進行を理解することの関連性を強調して神経変性変化高齢マウスにおける歩行分析を行った.
運動障害に加えて神経変性疾患の動物モデルはしばしば検討タスクに焦点を当て問題を抱えるし、加齢と共に特に顕著な認知障害を示します。このような表現型はモーターの動作テストの結果に影響を与えます。すなわち、rotarod テスト16、運動障害を調べる最も広く使用されている試験の一つは、認知、注意、およびストレス17,18に依存します。モーターを備えられたトレッドミルの上を歩く意欲は、またこれらの要因によって異なります記録の読み出しを実行すると、標準的な機能であるし、これまで変更された認知の影響は小さい。ストレスと注意の影響は、全体的な実行能力ではなくスイング ・ スタンス時間の応力、および注意19、20SL のような特定のパラメーターで表示ことがあります。
運動学的歩行分析のアプローチをさらに齧歯動物モデルの課題を調整するオプションを持つことの利点を提供しています。調整可能な角度とスピードでトレッドミルにより、歩行速度 0.1 ~ 99.9 cm/s、重度の歩行障害を持つ齧歯類は遅い速度で実行することができますように (~ 10 cm/s)。高速走行速度で測定できる非障害動物 (30 – 40 cm/s)。テストの動物が一定の速度で実行することができるかどうかの観察は、それ自体で結果を提供します。さらに、齧歯類は、ゴニオメータの助けを借りて、希望の角度にトレッドミルを傾けることによってまたは加重そりをマウスまたはラットの後肢にアタッチすることにより減少、上下、傾斜を実行するさらに挑戦しました。
患者で変異が単一のタンパク質の多くの研究に加えて不良エンドサイトーシス プロセスと神経変性13,21,22、間のリンクの最近の増加の意識があります。 23,24,25,26,,2728。エンドフィリン A の減らされたレベルを持つモデルをマウス (今後エンドフィリン) 両方クラスリン依存性エンドサイトーシス13,21,の29,30,31の主要プレイヤー,32,33,45とクラスリン依存エンドサイトーシス34、神経変性を示し、自発運動13,21の年齢に依存して障害が判明しました。3 つの遺伝子をエンコード エンドフィリン蛋白質の家族: エンドフィリン エンドフィリン 2、1 とエンドフィリン 3。特に、エンドフィリン蛋白質の枯渇から生じる表現型は数によって大幅に異なりますエンドフィリン遺伝子13,21を不足しています。トリプル ノック アウト (KO) エンドフィリン遺伝子は致死が誕生と両方のエンドフィリン 1 と 2 失敗繁栄し、出産後 3 週間以内に死亡することがなくマウス後わずか数時間、3 つの endophilins のいずれかの単一の KO を示しています明白な表現型のテスト条件21。他エンドフィリン変異遺伝子は減らされた寿命を表示し、年齢13の増加と運動障害を開発します。例、エンドフィリン 1KO 2HT 3KO マウス表示歩行変化と運動協調性問題 (運動学的歩行分析と rotarod によってテスト) としての同腹子ながら、生後 3 か月ですでにエンドフィリン 1KO 2WT 3KO 動物表示重要です年齢13の 15 ヶ月間は運動協調性が減少します。これらのモデルにおける表現型の広大な多様性のため、識別し、さまざまな動物のモーター認知能力と時代に対応する課題を統合することができますテストを適用する必要です。ここでは、発症および神経変性変化 (すなわち、エンドフィリン変異体) を示すマウス モデルにおける運動障害の進行を評価する運動学的歩行分析に活用実験の手順を詳しく説明します。様々 な年齢や歩行障害の重要度が異なるで歩行パラメーターの測定が含まれます。
Protocol
Representative Results
Discussion
神経変性疾患、特に PD 運動協調性は深刻な影響を受けるのような病気のためのモデルの特性評価に有用なアプローチは、運動の協調性を学ぶします。運動歩行分析の機能分析の助けを借りて、我々 は弱い神経変性とそれ故に比較的控えめな表現型歩行問題の発症で動物の歩行またはモデルの微妙な変化を識別できます。小さな歩行異常、重度の運動障害を含む神経変性疾患の様々 なモデル?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Eni 社の動物施設については、繁殖と博士ヌーノ ライムンド原稿の有用なコメントのために動物の世話人に感謝いたします。イオ ミンは Emmy Noether 若手研究者賞および SFB-1190 (P02)、プロジェクト共同研究センター SFB-889 (プロジェクト A8) を通じてドイツ研究振興協会 (DFG) からの補助金によってサポートされている (1702/1)。ガイドライン作成は、神経科学、生物物理学、分子生命科学 (GGNB) のゲッティンゲン大学院フェローシップによってサポートされます。
Materials
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA | DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware | |
| non-transparent blanket or dark cloth | cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress | ||
| balance | e.g. Satorius | balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g | |
| red finger paint | e.g. Kreul or Staedtler | for increasing the contrast between paws and animal’s body | |
| small paint brush | soft brush to apply finger paint to the animal paws | ||
| diluted detergent | for cleaning | ||
| disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol | e.g. B.Braun | for desinfection |
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