Análise de marcha de idade-dependente de perturbações Motor em camundongos com neurodegeneração
Summary
Neste estudo, vamos mostrar o uso da análise cinemática da marcha com base no plano ventral da imagem latente para monitorar as mudanças sutis na coordenação motora, bem como a progressão de neurodegeneração com o avançar da idade em modelos do rato (por exemplo, endophilin mutante linhas de rato).
Abstract
Testes de comportamento motor são comumente usados para determinar a relevância funcional de um modelo de roedor e testar recentemente desenvolvido tratamentos nestes animais. Especificamente, a análise de marcha permite doença recaptura fenótipos relevantes que são observados em pacientes humanos, especialmente em doenças neurodegenerativas que afetam as habilidades de motor tais como a doença de Parkinson (PD), a doença de Alzheimer (AD), amiotrófica esclerose lateral (ALS) e outros. Em estudos iniciais ao longo desta linha, a medição de parâmetros da marcha foi trabalhoso e dependida em fatores que foram difíceis de controle (por exemplo, velocidade, running corredor contínuo). O desenvolvimento de sistemas de imagens de avião ventral (VPI) viabilizados para realizar análise de marcha em grande escala, tornando este método uma ferramenta útil para a avaliação do comportamento motor em roedores. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado de como usar a análise cinemática da marcha para examinar a progressão de idade-dependente de déficit motor em modelos do rato de neurodegeneração; linhas de rato com diminuição dos níveis de endophilin, em que danos neurodegenerativas progressivamente aumenta com a idade, são usadas como um exemplo.
Introduction
Doenças neurodegenerativas imponham um encargo significativo para a sociedade, os doentes e as famílias e se tornará ainda maior preocupação com o aumento da expectativa de vida, e a população mundial continua a envelhecer. Um dos sintomas mais comuns de doenças neurodegenerativas são problemas de equilíbrio e mobilidade. Assim, a caracterização do comportamento motor no envelhecimento dos mamíferos (por exemplo, roedores) modelos, e/ou modelos mostrando neurodegenerativas fenótipos, é uma ferramenta valiosa para demonstrar a relevância na vivo , o modelo animal específico, ou terapêutica tratamentos que visam melhorar os sintomas da doença. Quase cada abordagem para tratar doenças neurodegenerativas, finalmente, requer testes em um modelo animal antes do início de um ensaio clínico em humanos. Portanto, é crucial ter testes de comportamento confiável e reproduzível que podem ser usados para quantificar consistentemente fenótipos doença relevantes ao longo da progressão da idade, a fim de garantir que uma droga de candidato, que mostrou potencial em um modelo in vitro , pode efetivamente melhora o fenótipo em um animal vivo.
Um dos aspectos da avaliação do comportamento motor em roedores é análise cinemática da marcha, que pode ser executada por VPI (também chamado plano ventral Videografia)1,2. Este método estabelecido capitaliza sobre gravação contínua da parte inferior dos roedores andando em cima de uma esteira motorizada e transparente correia1,2,3,4. Análise do vídeo alimentar dados cria “digital de pata” de todos os quatro membros que dinamicamente e confiantemente recapitular padrão ambulante do roedor, como originalmente descrita por Kale et al 2 e Amende et al 3.
O princípio da análise da marcha com base em imagem é medir a área de pata em contato com a correia de esteira ao longo do tempo, para cada pata individual. Cada postura é representada por um aumento na área de pata (em fase de travagem) e uma diminuição na área da pata (a fase de propulsão). Isto é seguido pela fase de balanço em que nenhum sinal é detectado. Balanço e postura junto formam um tranco. Além de parâmetros de dinâmica de marcha, parâmetros de postura podem também ser extraídos os vídeos gravados. Parâmetros exemplares e sua definição estão listados na tabela 1 e incluem postura largura (SW; a distância combinada as patas dianteiras ou traseiras ao eixo focinho-cauda), comprimento (SL; distância média entre dois avanços da mesma pata) do passo ou pata de colocação ângulo (o ângulo da pata ao eixo focinho-cauda). Os dados de postura e marcha dinâmica permitem tirar conclusões sobre equilíbrio animal (por parâmetros de postura e sua variabilidade ao longo de várias etapas) e coordenação (pelos parâmetros de dinâmica de marcha). Outros parâmetros, tais como coeficiente de ataxia (SL variabilidade calculada por [(max. SL−min. SL) / quero dizer SL]), membro posterior compartilhado postura (tempo que ambos os membros posteriores estão em contacto com o cinto), ou arrastar pata (área total da pata no cinto de postura completo para decolagem de pata) também podem ser extraídos e foram relatados para ser alterada em vários neurodegenerativas di Sease modelos5,6,7,8 (ver tabela 1).
| Parâmetro | Unidade | Definição |
| tempo de balanço | MS | duração de tempo que a pata não está em contacto com o cinto |
| tempo de postura | MS | duração de tempo que a pata está em contato com a correia |
| % de freio | % de tempo de postura | porcentagem de tempo de postura, que as patas estão em fase de freio |
| propel % | % de tempo de postura | porcentagem de tempo de postura, que as patas estão na fase de propulsão |
| largura de postura | cm | distância combinada das patas dianteiras ou traseiras ao eixo focinho-cauda |
| comprimento do passo | cm | distância média entre dois passos a pata mesmo |
| frequência de passo | passos/s | número de passos completos por segundo |
| ângulo de colocação de pata | DEG | ângulo da pata em relação ao eixo de focinho-cauda do animal |
| coeficiente de ataxia | u.a. | Variabilidade de SL calculado por [(max SL-min SL)/média SL] |
| posição compartilhada % | % de postura | tempo de postura de membro posterior compartilhado; vez que ambos os membros posteriores estão em contacto com o cinto, ao mesmo tempo |
| pata de arrastar | mm2 | área total da pata no cinto de postura completo para pata de decolagem |
| carregamento de membro | cm2 | MAX dA/dT; máxima taxa de variação da área de pata na fase de quebra |
| variação do ângulo de passo | DEG | desvio-padrão do ângulo entre o hind patas em função do SL e SW |
Tabela 1. Definição de parâmetros de chave da marcha que pode ser testado por imagem avião ventral.
Avaliar o comportamento motor dos modelos de roedores para doenças neurodegenerativas pode ser desafiador dependendo da gravidade do fenótipo de um modelo específico em uma determinada idade. Várias doenças, mais proeminentemente PD, mostrar forte comportamento motor (locomoção) déficits, tanto em pacientes e em modelos animais. Um dos quatro principais sintomas em PD é bradicinesia, que progride com o envelhecimento e se manifesta em deficiências severas da marcha já em estágios iniciais de PD9. Estudos do modelo PD agudo, roedores tratados com 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), já utilizados de11,de10,para análise de marcha VPI12. No entanto, dada a natureza aguda deste modelo, estes estudos não se dirija a progressão relacionadas com a idade de déficit motor. Vários estudos recentes têm realizado análise de marcha em ratos envelhecidos com alterações neurodegenerativas, por exemplo,13,14,15, enfatizando a importância de compreender a progressão da doença com o avançar da idade .
Além do déficit motor, modelos animais de doenças neurodegenerativas frequentemente têm dificuldades, enfocando as tarefas de exame e mostram deficiências cognitivas proeminentes, em especial com o avançar da idade. Tal um fenótipo pode influenciar o resultado dos testes de comportamento motor. Ou seja, um dos testes mais utilizados para examinar os défices de motor, o teste rotarod16, baseia-se na cognição, atenção e esforço17,18. Enquanto a vontade de andar em uma esteira motorizada também depende desses fatores, a leitura gravada está em execução, que é uma característica mais padronizada e muito menos influenciada pela cognição alterada. Efeitos do estresse e atenção podem ser visíveis em parâmetros específicos, como tempo de balanço/postura para estresse e SL para atenção19,20, mas não na capacidade de execução global.
A abordagem de análise cinemática da marcha ainda oferece a vantagem de ter opções para ajustar o desafio para os modelos de roedores. A esteira com ângulo ajustável e velocidade permite andar a velocidades de 0,1 – 99,9 cm/s, para que os roedores com graves deficiências ambulante podem ainda ser capazes de correr a uma velocidade lenta (~ 10 cm/s). Animais com deficiência não podem ser medidos em correr mais rápido velocidades (30 – 40 cm/s). A observação de ou não os animais testados são capazes de executar em uma certa velocidade proporciona um resultado por si só. Além disso, o roedor pode ser adicionalmente desafiado para executar um plano inclinado, ou para baixo de um declínio, pela inclinação da esteira para um ângulo desejado com o auxílio de um goniômetro, ou anexando um trenó ponderado a mouse ou rato membros posteriores.
Além de numerosos estudos de proteínas simples que são uma mutação em pacientes, há uma crescente conscientização recente das ligações entre defeituoso endocitose processo e neurodegeneração13,21,22, 23,24,25,26,,27,28. Modelos com níveis reduzidos de endophilin-A de rato (doravante endophilin), um jogador-chave em ambos endocitose mediada por Clatrina13,21,29,30,31 , 32 , 33 , 45 e independente de Clatrina endocitose34, foram encontrados para mostrar a neurodegeneração e deficiências de idade-dependente na atividade locomotora13,21. Três genes codificam a família de proteínas de endophilin: endophilin 1, endophilin 2 e endophilin 3. Notavelmente, o fenótipo resultante da depleção de proteínas endophilin varia muito consoante o número de desaparecidos endophilin genes13,21. Enquanto triplo nocaute (KO) de todos os endophilin de genes é letal apenas algumas horas após o nascimento e os ratos sem ambos endophilin 1 e 2 não conseguem prosperar e morrem dentro de 3 semanas após o nascimento, KO único para qualquer um dos três endophilins não mostra nenhum fenótipo óbvio para testados condições de21. Outros genótipos mutantes endophilin mostram vida útil reduzida e desenvolvem deficiências motor com o aumento da idade13. Por exemplo, endophilin 1KO-2HT-3KO ratos exposição ambulante alterações e problemas de coordenação motora (como testado pelo rotarod e análise cinemática da marcha) já aos 3 meses de idade, enquanto seus littermates, endophilin 1KO-2WT-3KO animais, exibir um significativo redução da coordenação motora, somente em 15 meses de idade13. Devido a vasta diversidade de fenótipos nestes modelos, é necessário identificar e aplicar um teste que pode integrar uma variedade de desafios correspondente ao motor do animal e cognição habilidades, bem como a idade. Aqui, detalhamos os procedimentos experimentais que capitalizar a análise cinemática da marcha para avaliar o início e a progressão da deficiência motor em um modelo do rato que mostra alterações neurodegenerativas (i.e., endophilin mutantes). Isso inclui a medição de parâmetros da marcha em várias idades e diferentes severidades de deficiências de locomoção.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estudar a coordenação motora é uma abordagem útil na caracterização de modelos de doenças neurodegenerativas, especialmente para doenças como a PD em que a coordenação motora é severamente afectada. Com a ajuda de um ensaio funcional de análise cinemática da marcha, podemos identificar mudanças sutis na marcha de animais no início dos problemas de locomoção, ou em modelos com neurodegeneração fraca e, portanto, relativamente modesto fenótipo. Dada a grande variedade de fenótipos em vários modelos de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a cuidadores de animais em instalações de animais do ENI para ajuda com a criação e Dr. Nuno Raimundo para comentários úteis sobre o manuscrito. I.M. é suportado por subvenções da Fundação pesquisa alemã (DFG) através do centro de investigação em colaboração SFB-889 (projeto A8) e SFB-1190 (projeto P02) e o Emmy Noether Young Investigator Award (1702/1). C.M.R. é suportado pela sociedade da escola de pós-graduação de Göttingen para Neurociências, biofísica e Biociências moleculares (GGNB).
Materials
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA | DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware | |
| non-transparent blanket or dark cloth | cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress | ||
| balance | e.g. Satorius | balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g | |
| red finger paint | e.g. Kreul or Staedtler | for increasing the contrast between paws and animal’s body | |
| small paint brush | soft brush to apply finger paint to the animal paws | ||
| diluted detergent | for cleaning | ||
| disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol | e.g. B.Braun | for desinfection |
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