Analisi del passo di età-dipendente motorie in topi con il Neurodegeneration
Summary
In questo studio, dimostriamo l’uso dell’analisi cinematica andatura basato su piano ventrale di imaging per monitorare i cambiamenti sottili nella coordinazione motoria, come pure la neurodegenerazione con l’avanzare dell’età in modelli murini (ad es., endophilin mutante linee del mouse).
Abstract
Test di comportamento motorio sono comunemente usati per determinare la rilevanza funzionale di un modello del roditore e per testare recentemente sviluppato trattamenti in questi animali. In particolare, l’analisi del passo permette riconquista malattia fenotipi rilevanti che sono osservati in pazienti umani, soprattutto nelle malattie di neurodegenerative che influiscono sulla capacità motorie come la malattia di Parkinson (MDP), morbo di Alzheimer (annuncio), amiotrofica sclerosi laterale (ALS) e altri. Nei primi studi lungo questa linea, la misura di parametri di andatura era faticoso e dipendeva da fattori che erano difficili da controllare (ad es., velocità, funzionamento continuo). Lo sviluppo piano ventrale (VPI) di sistemi di imaging reso fattibile per eseguire analisi di andatura a larga scala, rendendo questo metodo uno strumento utile per la valutazione del comportamento del motore nei roditori. Qui, presentiamo un protocollo approfondito di come utilizzare analisi cinematica di andatura per esaminare la progressione di età-dipendente di deficit motori in modelli murini di neurodegenerazione; linee del mouse con diminuzione dei livelli di endophilin, in cui neurodegenerative danno aumenta progressivamente con l’età, sono usate come esempio.
Introduction
Malattie neurodegenerative impongano un onere significativo per i pazienti, le famiglie e la società e diventeranno ancora più preoccupante come aumento della speranza di vita, e la popolazione mondiale continua ad invecchiare. Uno dei sintomi più comuni di malattie neurodegenerative sono problemi di mobilità e dell’equilibrio. Così, la caratterizzazione del comportamento del motore nell’invecchiamento dei mammiferi (ad es., roditore) modelli e/o modelli che mostrano fenotipi neurodegenerative, è un prezioso strumento per dimostrare l’importanza in vivo del modello animale specifico (s), o terapeutico trattamenti che mirano a migliorare i sintomi della malattia. Quasi ogni approccio per il trattamento di malattie neurodegenerative in definitiva richiede il test in un modello animale prima dell’inizio di una sperimentazione clinica nell’uomo. Pertanto, è fondamentale avere test di comportamento affidabile, riproducibile, che può essere utilizzato per quantificare costantemente fenotipi rilevanti per la malattia lungo progressione di età, al fine di garantire che un farmaco candidato, che ha mostrato potenziale in un modello in vitro , può effettivamente migliorare il fenotipo in un animale vivente.
Uno degli aspetti della valutazione del comportamento del motore nei roditori è analisi cinematica di andatura, che può essere eseguita da VPI (anche chiamato piano ventrale Videografia)1,2. Questo metodo stabilito capitalizza la registrazione continua della parte inferiore dei roditori a piedi sulla cima di un tapis roulant motorizzato e trasparente cintura1,2,3,4. Analisi del video feed dati crea “digitale paw prints” di tutte e quattro le membra che dinamicamente e in modo affidabile ricapitolano a piedi modello di roditore, come originariamente descritto da Kale et al. 2 e Amende et al. 3.
Il principio dell’analisi di andatura basata su formazione immagine è di misurare l’area di zampa a contatto con il nastro nel corso del tempo, per ogni zampa individuo. Ogni posizione è rappresentata da un aumento nella zona di zampa (in fase di frenata) e una diminuzione nella zona di zampa (in fase di propulsione). Segue la fase di oscillazione in cui viene rilevato alcun segnale. Swing e atteggiamento insieme formano una falcata. Oltre ai parametri di dinamiche di andatura, parametri di postura possono essere estratta anche dai video registrati. Parametri di esemplari e la loro definizione sono elencati nella tabella 1 e includono larghezza stance (SW; la distanza combinata tra le zampe anteriori o posteriori e l’asse del muso-coda), lunghezza (SL; distanza media tra due passi della zampa stessa) della falcata o paw posizionamento angolo (l’angolo della zampa all’asse del muso-coda). I dati di dinamiche andatura e postura consentono di trarre conclusioni sull’equilibrio degli animali (dai parametri di postura e la loro variabilità diversi passi) e coordinamento (dai parametri di dinamiche di andatura). Altri parametri, come coefficiente di atassia (la variabilità di SL calcolata da [(max. SL−min. SL) / dire SL]), dell’arto ha condiviso la posizione (tempo che entrambi gli arti posteriori sono a contatto con la cinghia), o trascinamento della zampa (superficie totale della zampa alla cintura da completo posizione a zampa Lift-off) può anche essere estratta e sono stati segnalati per essere cambiato in vari neurodegenerative di Sease modelli5,6,7,8 (Vedi tabella 1).
| Parametro | Unità | Definizione |
| tempo di oscillazione | MS | durata di tempo che la zampa non è a contatto con la cinghia |
| tempo di presa di posizione | MS | durata di tempo che la zampa è a contatto con la cinghia |
| freno di % | % del tempo di presa di posizione | percentuale del tempo di presa di posizione che le zampe sono in fase di freno |
| spingere % | % del tempo di presa di posizione | percentuale del tempo di presa di posizione che le zampe sono in fase di propulsione |
| larghezza di presa di posizione | cm | distanza combinato dalle zampe anteriori o posteriori all’asse del muso-coda |
| lunghezza della falcata | cm | distanza media tra due passi della stessa zampa |
| frequenza di falcata | passi/s | numero di passi completi al secondo |
| angolo di posizionamento di zampa | deg | angolo della zampa rispetto all’asse del muso-coda dell’animale |
| coefficiente di atassia | a.u. | Variabilità di SL calcolato da [(max SL-min SL)/media SL] |
| posizione condivisa % | % della posizione | tempo di atteggiamento dell’arto ha condiviso; momento in cui entrambi gli arti posteriori sono a contatto con la cinghia allo stesso tempo |
| trascinamento di zampa | mm2 | superficie totale della zampa alla cintura da completo posizione a zampa a sollevamento |
| caricamento dell’arto | cm2 | MAX dA/dT; tasso massimo di cambiamento di zona zampa nella fase di rottura |
| variabilità di angolo di passaggio | deg | deviazione standard dell’angolo tra hind zampe in funzione della SL e SW |
Tabella 1. Definizione dei parametri di andatura chiave che possono essere testati da formazione immagine piano ventrale.
Valutare il comportamento del motore di modelli di roditori per le malattie neurodegenerative può essere difficile a seconda della gravità del fenotipo di un modello specifico ad una certa età. Diverse malattie, più prominente PD, Visualizza forte comportamento motorio (locomozione) deficit, sia nei pazienti e nei modelli animali. Uno dei quattro sintomi chiavi nel PD è bradicinesia, che progredisce con l’invecchiamento e si manifesta in disabilità grave andatura già nelle prime fasi della PD9. Gli studi del modello PD acuto, roditori trattati con 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), hanno già usato VPI andatura analisi10,11,12. Tuttavia, data la natura acuta di questo modello, questi studi non affrontano la progressione senile di deficit motori. Parecchi studi recenti hanno condotto analisi di andatura in topi invecchiati con cambiamenti neurodegenerative, ad esempio13,14,15, sottolineando l’importanza di comprendere la progressione di malattia con l’avanzare dell’età .
Oltre ai deficit motori, modelli animali di malattie neurodegenerative spesso hanno difficoltà di messa a fuoco sulle mansioni in esame e visualizza prominenti danni conoscitivi, in particolare con l’avanzare dell’età. Tale un fenotipo possa influenzare il risultato delle prove di comportamento motorio. Vale a dire, uno dei test più ampiamente usato per esaminare i deficit del motore, il rotarod test16, si basa sulla cognizione, attenzione e sforzo17,18. Mentre la volontà di camminare su un tapis roulant motorizzato dipende anche da questi fattori, la lettura registrata è in esecuzione, che è una caratteristica più standardizzata e molto meno influenzato dalla cognizione alterata. Effetti dello stress e attenzione potrebbero essere visibili in parametri specifici, come il tempo di oscillazione/atteggiamento per lo stress e SL per attenzione19,20, ma non in generale abilità corrente.
Ulteriormente l’approccio di analisi cinematica andatura offre il vantaggio di avere opzioni per regolare la sfida per i modelli del roditore. Il tapis roulant con inclinazione regolabile e velocità permette a piedi di velocità da 0,1 – 99,9 cm/s, così che i roditori con grave disabilità a piedi possono essere ancora in grado di eseguire a bassa velocità (~ 10 cm/s). Animali con problemi di vista non possono essere misurati a correre più veloci velocità (30 – 40 cm/s). L’osservazione di animali siano o meno in grado di eseguire a una certa velocità fornisce un risultato di per sé. Ulteriormente, il roditore può essere inoltre contestato per eseguire su un piano inclinato o giù un declino, inclinando il tapis roulant per un angolo desiderato con l’aiuto di un goniometro, o collegando una slitta ponderata a zampe di topo o ratto.
Oltre a numerosi studi di singole proteine che sono mutati in pazienti, c’è una recente crescente consapevolezza dei legami tra endocitosi difettoso processo e neurodegenerazione13,21,22, 23,24,25,26,27,28. Modelli con livelli ridotti di endophilin-A murini (d’ora in poi endophilin), un giocatore chiave in entrambi endocytosis clathrin-mediato13,21,29,30,31 , 32 , 33 , 45 ed endocitosi clatrina-indipendente34, sono stati trovati per mostrare neurodegenerazione e danni età-dipendenti in attività locomotrice13,21. Tre geni codificano la famiglia delle proteine endophilin: endophilin 1, endophilin 2 ed endophilin 3. In particolare, il fenotipo risultante dalla deplezione delle proteine endophilin varia notevolmente a seconda del numero dei dispersi endophilin geni13,21. Mentre triple knock-out (KO) di tutti i geni di endophilin è letale solo poche ore dopo la nascita e topi senza entrambi endophilin 1 e 2 non riescono a prosperare e morire entro 3 settimane dopo la nascita, singolo KO per una qualsiasi delle tre endophilins non mostra nessun fenotipo evidente per testate condizioni21. Altri genotipi mutanti endophilin mostrano ridotta durata della vita e sviluppano motorie con l’aumento dell’età13. Ad esempio, endophilin 1KO-2HT-3KO topi esposizione ambulante alterazioni e problemi di coordinazione motoria (come provato da rotarod e analisi cinematica di andatura) già a 3 mesi dell’età, mentre loro littermates, endophilin 1KO-2WT-3KO animali, visualizzare un significativo riduzione nella coordinazione motoria solo a 15 mesi di età13. A causa della grande diversità dei fenotipi in questi modelli, è necessario identificare e applicare un test che può integrare una varietà di sfide corrispondente al motore dell’animale e la capacità di cognizione, come pure l’età. Qui, abbiamo dettaglio le procedure sperimentali che capitalizzare l’analisi cinematica andatura per valutare l’insorgenza e la progressione del motorie in un modello murino che mostra cambiamenti neurodegenerative (cioè, endophilin mutanti). Questo include andatura parametri di misura alle varie età e diversi livelli di gravità della disabilità di locomozione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Studiare la coordinazione motoria è un approccio utile nella caratterizzazione di modelli di malattie neurodegenerative, soprattutto per le malattie come PD in cui coordinazione motoria è gravemente colpiti. Con l’aiuto di un test funzionale di analisi cinematica andatura, possiamo identificare sottili cambiamenti nell’andatura degli animali al momento della comparsa di problemi di locomozione, o nei modelli con debole neurodegenerazione e quindi relativamente modesto fenotipo. Data l’ampia gamma di fenotipi in vari mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo i guardiani animali presso la struttura animale di ENI per aiuto con l’allevamento e Dr. Nuno Raimundo per commenti utili sul manoscritto. I.M. è supportato dalle sovvenzioni dalla Fondazione di ricerca tedesca (DFG) attraverso il centro di ricerca collaborativa SFB-889 (progetto A8) e SFB-1190 (progetto P02) ed Emmy Noether Young Investigator Award (1702/1). C.m.r. è supportato dalla compagnia dalla scuola di specializzazione di Gottinga per neuroscienze, biofisica e bioscienze molecolari (GGNB).
Materials
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA | DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware | |
| non-transparent blanket or dark cloth | cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress | ||
| balance | e.g. Satorius | balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g | |
| red finger paint | e.g. Kreul or Staedtler | for increasing the contrast between paws and animal’s body | |
| small paint brush | soft brush to apply finger paint to the animal paws | ||
| diluted detergent | for cleaning | ||
| disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol | e.g. B.Braun | for desinfection |
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