猕猴免疫缺陷病毒感染 CD4+ T 细胞单细胞定量的 mRNA 和表面蛋白的表达
Summary
描述的方法, 以定量的表达96基因和18表面蛋白的单细胞前体, 允许鉴定差异表达基因和蛋白质的病毒感染细胞相对未感染的细胞。我们采用这种方法来研究与恒河猴分离的 SIV 感染的 CD4+ T 细胞。
Abstract
单细胞分析是解剖细胞异质种群的重要工具。稀有细胞的鉴别和分离可能是困难的。为克服这一挑战, 开发了一种结合指数流式细胞仪和高通量多路聚合酶链反应 (qPCR) 的方法。目的是确定和鉴定猕猴体内存在的猿猴免疫机能丧失病毒 (SIV) 感染细胞。通过荧光活化细胞分选 (qPCR) 和 mRNA 对表面蛋白进行定量测定, 通过病毒基因表达识别病毒感染细胞, 并与宿主基因和蛋白质测量相结合, 创建多维剖面图。.我们的方法, 目标单细胞 Proteo 转录评价, 或 tSCEPTRE。为了执行该方法, 活细胞被染色的荧光抗体特定的表面标记用于外地的细胞子集和/或下游表型分析隔离。单细胞排序后, 立即裂解, 多重反转转录 (RT), PCR 预扩, 高通量 qPCR 高达96成绩单。在分类时记录了这些测量结果, 然后通过良好的位置与基因表达数据联系在一起, 形成了蛋白质和转录剖面的组合。通过对多种病毒 RNA 种类的qPCR 检测, 对细胞进行直接的体外研究。病毒转录和数量的结合提供了一个框架, 将细胞划分为病毒生命周期的不同阶段 (例如, 生产性与非生产性)。此外, 将 SIV+细胞的 tSCEPTRE 与同标本分离的未感染细胞进行比较, 以评估差异表达的宿主基因和蛋白质。分析表明, 以前不赏识病毒 RNA 表达的异质性之间的感染细胞, 以及体内SIV 介导的转录后基因调节与单细胞分辨率。tSCEPTRE 方法适用于通过表达表面蛋白标记, 宿主或病原体基因, 或其组合, 对任何能够识别的细胞群体进行分析。
Introduction
许多胞内病原体依赖宿主细胞机械进行复制, 经常改变宿主细胞生物学, 或针对宿主细胞的非常特定的亚群, 以最大限度地提高它们的传播几率。因此, 细胞生物学过程通常被打乱, 对宿主的整体健康造成有害影响。了解病毒与它们复制的宿主细胞之间的相互作用将阐明可能有助于发展改进的治疗方法和预防感染的策略的疾病机制。能够研究寄主-病原体相互作用的直接分析工具对这一目的至关重要。单细胞分析提供了唯一的方法, 明确地将细胞表型归因于特定基因型, 或感染状态1。例如, 病原体感染经常引起宿主细胞的直接和间接变化。因此, 区分受感染细胞与未感染的对应者是必要的, 将宿主细胞的变化归因于直接感染或次生效应, 如广泛性炎症。此外, 对许多病原体, 如 SIV 和人体免疫机能丧失病毒 (HIV), 宿主细胞感染通过多个阶段, 如早期, 晚期, 或潜伏, 其中每一个可能的特点是不同的基因和蛋白表达谱2,3,4,5. 对细胞混合物的大量分析将无法捕获这种异质性6。相比之下, 高度复用的单细胞分析能够量化病毒和宿主基因的表达, 提供了一种方法来解决感染特定的细胞扰动, 包括跨感染阶段的变化。此外, 分析宿主-病原体在生理相关设置中的相互作用对于鉴定发生在受感染生物体中的事件至关重要。因此, 可以直接应用于体内的方法很可能在体内过程中获得最佳的捕获。
SIV 和 HIV 靶 CD4+ T 细胞, 他们抵消宿主抗病毒 “限制” 因素和 downregulate 抗原提出分子, 以建立生产性感染和避免免疫监测7,8, 9,10,11。如果没有治疗, 感染会导致 CD4 和 T 细胞的大量损失, 最终达到后天免疫机能丧失综合症 (艾滋病)12的高潮。在抗逆转录病毒治疗的设置中, 潜伏感染的细胞库持续了数十年, 给治疗策略带来了巨大的障碍。了解体内艾滋病毒/SIV 感染细胞的性质, 有可能揭示宿主细胞的功能在发病机制和持久性。然而, 这是非常有挑战性的, 主要是由于感染细胞的频率低和缺乏试剂能够轻易辨认出来。转录病毒 RNA 的细胞, 估计是存在于血液和淋巴组织的 CD4+ T 细胞的 0.01–1%13,14,15。在压制疗法下, 潜伏感染细胞在 10-3–10-7 16,17,18, 更不频繁。用于研究体外感染的病毒蛋白染色方法, 例如胞内封堵, 由于0.01–0.1% 的背景染色, 类似或大于感染细胞13的频率, 是次优, 14。使用具有良好特征的 SIV/HIV 病毒特定单克隆抗体的表面染色也被证明是困难的, 可能是出于类似的原因。最近, 新的工具的目的是改善检测的细胞表达的插科打诨, 要么纳入特定的化验方法, 或使用替代成像技术14,15,19。然而, 这些方法在对每个细胞进行的定量测量数量上仍然有限。
在这里, 我们描述了 (1) 通过敏感和特异的病毒基因定量 qPCR 识别单个病毒感染细胞的方法, (2) 量化了多达18种表面蛋白和96个基因的表达, 每个感染者 (和未感染) 细胞。这种方法结合了单细胞表面蛋白的测量, 其次是立即细胞裂解和基因表达分析使用多路定向 qPCR Biomark 系统。集成的射流电路 (IFC) 技术允许96个基因的多重定量从96个样品同时, 完成由9216个室的矩阵, 其中个体 qPCR 反应被执行。活细胞转录的分类记录高含量的蛋白质丰度测量, 同时保留整个进行分析后立即进行下游。为了识别受病毒感染的细胞, 在 qPCR 分析中包括了用于交替拼接和 unspliced 病毒 rna (vRNA) 的特定化验, 连同一组用户定义的化验, 总计多达96个基因, 目前所容纳的最大化验数量国际金融公司。为每个细胞收集的基因表达和蛋白质信息是由良好的位置联系在一起的。我们以前在别处报告了这一分析结果20。在这里, 我们提供更详细的方法学指导和进一步描述分型的 SIV 感染 CD4+ T 细胞。
这种方法, 我们的期限 tSCEPTRE, 可以适用于任何可行的细胞群体的悬浮反应荧光标记抗体和表达转录兼容可用 qPCR 化验。例如, 它可以用来表征在稀有细胞中的差异基因和蛋白质表达, 而不容易与表面蛋白标记区分的细胞。样品准备依赖于标准染色协议使用商业上可用的抗体。具有单细胞分拣能力的 Cytometers 也可以在商业上获得, 但是处理传染性活细胞需要额外的生物安全预防措施。通过井位记录每个单元格的单细胞蛋白表达谱, 此处称为索引排序, 是商业上可使用的流式程序排序软件的一个常见特征。在感兴趣的细胞群中差异表达宿主基因的计算分析这里没有描述, 但参考被提供给以前发布的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里描述的协议, 称为 tSCEPTRE, 集成单细胞表面蛋白定量的多参数流式细胞仪与数量单一细胞 mRNA 表达的高复用 RT qPCR。这两种技术的结合使高容量的单细胞转录和蛋白质剖面快照具有高通量格式。我们使用该方法来识别在体内感染 SIV 的迄今难以捉摸的细胞, 并描述差异表达的宿主基因和蛋白质。该协议可用于研究任何感兴趣的细胞群体, 其表达的表面蛋白, mRNA, 或其组合。采用流式细胞仪?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢 NIAID VRC 流式细胞术核心和 MHRP 流式细胞仪核心设施, 以维护和操作的外地仪器和分拣设备;玛丽亚蒙特罗, Vishakha 夏尔马, 凯美歌曲为专家技术协助;迈克尔 Piatak (已故) 协助与 SIV qPCR 化验设计;布兰登上基尔和马修 Scarlotta 为 SIV 隔离序列。所表达的观点是作者的意见, 不应被解释为代表美国陆军或国防部的立场。根据《动物福利法》和与动物有关的动物和实验的其他联邦法规和条例, 在 AAALAC 认可的设施中进行了一项经批准的动物使用议定书的研究, 并遵守原则《实验室动物护理和使用指南》 (NRC) 发表, 2011 版。
Materials
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RNA extraction and PCR reagents and consumables |
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Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate |
BioExpress/VWR |
T-3060-1 |
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Adhesive PCR Plate Seals |
ThermoFisher |
AB0558 |
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Armadillo 384-well PCR Plate |
ThermoFisher |
AB2384 |
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MicroAmp Optical Adhesive Film |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4311971 |
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DEPC Water |
Quality Biological |
351-068-101 |
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Glass Distilled Water |
Teknova |
W3345 |
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Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
11732088 |
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SUPERase-In Rnase Inhibitor |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM2696 |
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Platinum Taq |
Invitrogen/ThermoFisher |
10966034 |
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dNTP Mix |
Invitrogen/ThermoFisher |
18427088 |
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ROX Reference Dye (if separate from kit) |
Invitrogen/ThermoFisher |
12223012 |
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DNA Suspension Buffer |
Teknova |
T0223 |
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RNAqueous kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM1931 |
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TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 |
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CD6 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs00198752_m1 |
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TLR3 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs1551078_m1 |
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Biomark reagents |
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Control Line Fluid Kit |
Fluidigm |
89000021 |
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TaqMan Universal PCR Mix |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4304437 |
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Assay Loading Reagent |
Fluidigm |
85000736 |
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Sample Loading Reagent |
Fluidigm |
85000735 |
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Dynamic Array 96.96 (chip) |
Fluidigm |
BMK-M-96.96 |
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FACS reagents |
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SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) |
Spherotech Inc. |
CMIgP-30-5H |
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CompBeads Anti-Mouse Ig,k |
BD Biosciences |
51-90-9001229 |
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5 ml Polystyrene tube with strainer cap |
FALCON |
352235 |
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Aqua Live/Dead stain |
Invitrogen/ThermoFisher |
L34976 |
dilute 1:800 |
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Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 |
BD Biosciences |
563916 |
dilute 1:40 |
|
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 |
BD Biosciences |
563914 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 |
BD Biosciences |
564804 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 |
Biolegend |
302948 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 |
BD Biosciences |
564710 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 |
Biolegend |
301842 |
dilute 1:83 |
|
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 |
Biolegend |
302048 |
dilute 1:167 |
|
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 |
Biolegend |
302340 |
dilute 1:37 |
|
Anti-CD38-R PE clone OKT10 |
NHP reagent recource |
N/A |
dilute 1:100 |
|
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 |
BD Biosciences |
564364 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 |
BD Biosciences |
561358 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A |
Biolegend |
313528 |
dilute 1:80 |
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Instruments |
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BioPrptect Containment Enclosure |
Baker |
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BD FACS Aria |
BD Biosciences |
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ProtoFlex Dual 96-well PCR system |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4484076 |
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Quant Studio 6 qPCR instrument |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4485694 |
|
|
IFC controller HX |
Fluidigm |
IFC-HX |
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|
Biomark HD |
Fluidigm |
BMKHD-BMKHD |
References
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