Cella singola quantificazione del mRNA e l'espressione di proteine di superficie CD4 infettati da Virus di immunodeficienza delle scimmie+ T cellule isolate da macachi Rhesus
Summary
Descritto è una metodologia per quantificare l’espressione di 96 geni e 18 proteine di superficie da singole cellule ex vivo, che consenta l’identificazione di differenzialmente espressi geni e proteine in cellule infettate da virus rispetto a cellule non infette. Applichiamo l’approccio allo studio SIV-infettati CD4+ T cellule isolate da macachi rhesus.
Abstract
Analisi unicellulare è uno strumento importante per la dissezione popolazioni eterogenee delle cellule. L’identificazione e l’isolamento di cellule rare può essere difficile. Per superare questa sfida, una combinazione di metodologia indicizzati citometria a flusso e reazione a catena della polimerasi quantitativa multiplex di alto-rendimento (qPCR) è stato sviluppato. L’obiettivo era di identificare e caratterizzare il virus dell’immunodeficienza delle scimmie (SIV)-cellule presenti all’interno di macachi rhesus infette. Attraverso la quantificazione della proteina di superficie ordinando fluorescenza-attivato delle cellule (FACS) e mRNA di qPCR, cellule infettate da virus sono identificate da espressione genica virale, che è combinata con misure di gene e la proteina di host per creare un profilo multidimensionale . Chiamiamo l’approccio, valutazione singola cellula Proteo-trascrizionale mirati o tSCEPTRE. Per eseguire il metodo, cellule vitali sono macchiate con anticorpi fluorescenti specifiche per gli indicatori di superficie utilizzati per l’isolamento di FACS di un sottoinsieme delle cellule e/o analisi fenotipica a valle. Singole celle vengono ordinate seguita dall’immediata Lisi, multisala trascrizione inversa (RT), pre-amplificazione di PCR e qPCR elevato throughput di fino a 96 trascrizioni. FACS misure sono registrate al momento dell’ordinamento e successivamente collegate a dati di espressione genica di ben posizionato per creare una proteina combinata e profilo trascrizionale. Per studiare la SIV-infettati direttamente cellule ex vivo, le cellule sono state identificate tramite rilevazione di qPCR di più specie di RNA virale. La combinazione di trascrizioni virali e la quantità di ciascuno forniscono un quadro per classificare le cellule in diversi stadi del ciclo di vita virale (ad es., produttivo contro non-produttiva). Inoltre, tSCEPTRE delle cellule SIV+ erano rispetto ai non infetti cellule isolate dallo stesso campione per valutare host differenzialmente espressi geni e proteine. L’analisi ha rivelato precedentemente incompreso eterogeneità di espressione RNA virale tra cellule infette come pure in vivo regolazione genica post-trascrizionale mediata SIV con cella singola ad alta risoluzione. Il metodo tSCEPTRE è rilevante per l’analisi di qualsiasi popolazione delle cellule suscettibili di identificazione dall’espressione della proteina di superficie marker(s), geni di host o agente patogeno o loro combinazioni.
Introduction
Molti agenti patogeni intracellulari si basano su macchina cellula ospite per replicare, spesso targeting molto specifiche sottopopolazioni di cellule dell’ospite per massimizzare le loro possibilità di propagazione o alterare la biologia delle cellule ospite. Di conseguenza, i processi biologici delle cellule sono comunemente perturbati, con conseguenze deleterie per la salute generale dell’ospite. Comprensione delle interazioni tra virus e cellule dell’ospite in cui si replicano chiariranno i meccanismi di malattia che possono essere di aiuto nello sviluppo di terapie migliori e le strategie per prevenire l’infezione. Diretti strumenti analitici che permettono lo studio delle interazioni ospite-patogeno sono essenziali verso questo fine. Cella singola analisi fornisce l’unico mezzo per attribuire inequivocabilmente un fenotipo cellulare ad un particolare genotipo o infezione di stato1. Ad esempio, infezioni da patogeni inducono frequentemente modifiche dirette e indirette in cellule ospiti. Pertanto, distinguendo le cellule infettate dalle loro controparti non infetti è necessario attributo host cella modifiche o infezione diretta o effetti secondari, come generalizzata infiammazione. Inoltre, per molti agenti patogeni, come SIV e virus di immunodeficenza umana (HIV), infezione delle cellule ospite procede attraverso fasi multiple, come presto, tardi, o latente, ognuno dei quali può essere caratterizzato da distinte gene e della proteina espressione profili2 , 3 , 4 , 5. analisi di massa di miscele di cella non riuscirà a catturare questa eterogeneità6. Al contrario, altamente multiplexed analisi unicellulare in grado di quantificare l’espressione di entrambi virale e geni ospitanti offrono un mezzo per risolvere specifici di infezione cellulare perturbazioni, comprese le varianti attraverso fasi di infezione. Ulteriormente, analizzando fisiologicamente interazioni ospite-patogeno in impostazioni rilevanti è fondamentale per l’identificazione di eventi che si verificano negli organismi infetti. Così, metodi che possono essere applicati direttamente ex vivo sono probabilmente migliori cattura in vivo i processi.
SIV e HIV CD4 di destinazione+ T cellule, in cui essi neutralizzare fattori antivirali “restrizione” ospite e downregulate antigene che presenta molecole per stabilire l’infezione produttiva ed evitare la sorveglianza immune7,8, 9,10,11. Senza trattamento, l’infezione si traduce in perdita massiccia di CD4 cellule+ T, in ultima analisi si conclude con acquistata di immunodeficenza (AIDS) la sindrome12. L’impostazione della terapia antiretrovirale, serbatoi latente infettate delle cellule persistono per decenni, che propone una formidabile barriera alle strategie curative. Comprendere le proprietà delle cellule in vivo HIV/SIV-infettati ha il potenziale per rivelare caratteristiche della cellula ospite strumentale nella patogenesi e persistenza. Tuttavia, questo è stato molto impegnativo, soprattutto dovuto le evacuazioni delle cellule infettate e mancanza di reagenti in grado di identificare prontamente. Cellule che trascrivono RNA virale, sono valutati per essere presente al 0,01 – 1% di CD4+ T cellule nel sangue e tessuto linfoide13,14,15. Sotto terapia soppressiva, cellule latente infettate sono anche meno frequenti al 10-3-10-7 16,17,18. Colorazione delle proteine virali saggi che lavorano bene per studiare in vitro infezioni, ad esempio per Gag intracellulare, sono non ottimale a causa di una colorazione di fondo di 0,01 – 0,1%, simile o maggiore della frequenza di cellule infettate13, 14. Marcatura di superficie per la proteina Env usando gli anticorpi monoclonali SIV/HIV Env-specifici ben caratterizzati inoltre ha dimostrato di essere difficile, probabilmente per motivi analoghi. Recentemente, nuovi strumenti mirano a migliorare la rilevazione di cellule esprimenti Gag da uno che incorporano dosaggi specifici per bavaglio RNA o utilizzando alternativo imaging technologies14,15,19. Tuttavia, tali approcci rimangono limitati nel numero di misurazioni quantitative eseguite su ciascuna cella.
Qui, descriviamo la metodologia che (1) identifica singole cellule infettate da virus direttamente ex vivo di qPCR quantitativa sensibile e specifico gene virale e (2) quantifica l’espressione di proteine di superficie fino a 18 e 96 geni per ogni infettati (e delle cellule non infette). Questa metodologia combina la misurazione di cella singola proteina di superficie di FACS seguita da lisi cellulare immediato e analisi di espressione genica utilizzando multiplexed qPCR mirata sull’apparato Biomark. La tecnologia del circuito integrato fluidico (IFC) consente di multiplex quantificazione di 96 geni da 96 campioni contemporaneamente, compiuta da una matrice di 9.216 alloggiamenti in cui vengono eseguite le reazioni individuali qPCR. L’ordinamento di cellule vive FACS registra ad alto contenuto proteico abbondanza misure mentre conservando l’intero trascrittoma per analisi eseguita immediatamente a valle. Per identificare le cellule infettate da virus, specifici saggi per alternativamente impiombate e unspliced virali RNA (vRNA) sono inclusi nell’analisi qPCR, insieme a un pannello di analisi definite dall’utente per un totale di fino a 96 geni, il numero massimo di analisi attualmente alloggiati in l’IFC. L’espressione genica e proteica informazioni raccolte per ogni cella sono collegate da ben posizionato. Precedentemente abbiamo segnalato i risultati di questa analisi altrove20. Qui, forniamo più dettagliate linee guida metodologiche, nonché ulteriormente descrittivo fenotipizzazione di SIV-infettati CD4+ T cellule.
Questo approccio, che chiamiamo tSCEPTRE, può essere applicato per le sospensioni di qualsiasi popolazione di cellule vitali reattivo agli anticorpi fluorescente identificati e che esprimono un transcriptome compatibile con saggi qPCR disponibili. Ad esempio, può essere utilizzato per la caratterizzazione genica differenziale ed espressione della proteina in cellule rare o cellule non facilmente distinguibili dai marcatori di proteina di superficie. La preparazione del campione si basa su uno standard di protocollo utilizzando anticorpi commerciali di colorazione. Citometri con cella singola funzionalità di ordinamento sono anche disponibili in commercio, ma biosicurezza ulteriori precauzioni sono necessarie per l’elaborazione di cellule vive infettive. Registrare il profilo di espressione di proteina delle cellule di singolo – per ogni cella di posizione ben, qui indicato come indicizzato l’ordinamento, è una caratteristica comune di FACS commercialmente disponibile software di ordinamento. Analisi computazionale di geni differenzialmente espressi ospitanti tra popolazioni cellulari di interesse non è descritto qui, ma vengono forniti riferimenti ai metodi precedentemente pubblicati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto qui, chiamato tSCEPTRE, integra la quantificazione di cella singola proteina di superficie mediante citometria a flusso multiparametrica con espressione quantitativa del mRNA unicellulare di altamente Multiplex RT-qPCR. L’Unione di queste due tecnologie consente ad alto contenuto istantanee della combinata trascrizionale e profilo proteico delle singole cellule in un formato ad alta velocità. Usiamo il metodo per identificare le celle precedentemente sfuggente infettate con SIV in vivoe …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare il NIAID VRC flusso Cytometry Core e le strutture di MHRP flusso Cytometry Core per la manutenzione e il funzionamento degli strumenti di FACS e ordinamento attrezzature; Maria Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song per assistenza tecnica; Michael Piatak, Jr. (defunti) per assistenza con progetto di SIV qPCR assay; e Brandon Keele e Matthew Scarlotta per SIV isolare sequenze. Le opinioni espresse sono quelle degli autori e non devono essere interpretate per rappresentare le posizioni dell’esercito degli Stati Uniti o il dipartimento della difesa. Ricerca è stato condotto secondo un protocollo approvato l’uso di animali in una struttura di AAALAC accreditati in conformità con l’Animal Welfare Act e altri statuti federali e regolamenti in materia di animali e gli esperimenti che coinvolgono animali e aderisce ai principi indicato nella Guida per la cura e uso di animali da laboratorio, NRC pubblicazione, edizione 2011.
Materials
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RNA extraction and PCR reagents and consumables |
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Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate |
BioExpress/VWR |
T-3060-1 |
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Adhesive PCR Plate Seals |
ThermoFisher |
AB0558 |
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Armadillo 384-well PCR Plate |
ThermoFisher |
AB2384 |
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MicroAmp Optical Adhesive Film |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4311971 |
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DEPC Water |
Quality Biological |
351-068-101 |
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Glass Distilled Water |
Teknova |
W3345 |
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Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
11732088 |
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SUPERase-In Rnase Inhibitor |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM2696 |
|
|
Platinum Taq |
Invitrogen/ThermoFisher |
10966034 |
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|
dNTP Mix |
Invitrogen/ThermoFisher |
18427088 |
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|
ROX Reference Dye (if separate from kit) |
Invitrogen/ThermoFisher |
12223012 |
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DNA Suspension Buffer |
Teknova |
T0223 |
|
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RNAqueous kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM1931 |
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TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 |
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CD6 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs00198752_m1 |
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TLR3 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs1551078_m1 |
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Biomark reagents |
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Control Line Fluid Kit |
Fluidigm |
89000021 |
|
|
TaqMan Universal PCR Mix |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4304437 |
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Assay Loading Reagent |
Fluidigm |
85000736 |
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|
Sample Loading Reagent |
Fluidigm |
85000735 |
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Dynamic Array 96.96 (chip) |
Fluidigm |
BMK-M-96.96 |
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FACS reagents |
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SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) |
Spherotech Inc. |
CMIgP-30-5H |
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|
CompBeads Anti-Mouse Ig,k |
BD Biosciences |
51-90-9001229 |
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|
5 ml Polystyrene tube with strainer cap |
FALCON |
352235 |
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Aqua Live/Dead stain |
Invitrogen/ThermoFisher |
L34976 |
dilute 1:800 |
|
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 |
BD Biosciences |
563916 |
dilute 1:40 |
|
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 |
BD Biosciences |
563914 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 |
BD Biosciences |
564804 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 |
Biolegend |
302948 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 |
BD Biosciences |
564710 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 |
Biolegend |
301842 |
dilute 1:83 |
|
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 |
Biolegend |
302048 |
dilute 1:167 |
|
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 |
Biolegend |
302340 |
dilute 1:37 |
|
Anti-CD38-R PE clone OKT10 |
NHP reagent recource |
N/A |
dilute 1:100 |
|
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 |
BD Biosciences |
564364 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 |
BD Biosciences |
561358 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A |
Biolegend |
313528 |
dilute 1:80 |
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Instruments |
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BioPrptect Containment Enclosure |
Baker |
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BD FACS Aria |
BD Biosciences |
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|
ProtoFlex Dual 96-well PCR system |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4484076 |
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Quant Studio 6 qPCR instrument |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4485694 |
|
|
IFC controller HX |
Fluidigm |
IFC-HX |
|
|
Biomark HD |
Fluidigm |
BMKHD-BMKHD |
References
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).
- Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence. Retrovirology. 10, 41 (2013).
- Mailler, E., et al. The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 8 (9), (2016).
- Varmus, H. Retroviruses. Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).
- Frankel, A. D., Young, J. A. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).
- Tokarev, A., Guatelli, J. Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence. Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).
- Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
- Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence. Viruses. 8 (3), 67 (2016).
- Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape. Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).
- Kirchhoff, F. Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses. Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).
- Wigzell, H. Immunopathogenesis of HIV infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).
- Reynolds, M. R., et al. Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).
- Baxter, A. E., et al. Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals. Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).
- Grau-Exposito, J., et al. A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients. MBio. 8 (4), (2017).
- Eriksson, S., et al. Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies. PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).
- Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
- Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).
- DeMaster, L. K., et al. A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy. J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).
- Bolton, D. L., et al. Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells. PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).
- Quintans, J., Lefkovits, I. Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system. Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).
- Finak, G., et al. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data. Genome Biol. 16, 278 (2015).
- McDavid, A., et al. Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).
- McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data. Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).
- Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time. Trends Microbiol. , (2017).
- Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 239, 55-68 (2017).
- Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Soh, K. T., et al. Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins. Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).
- Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).
- Assarsson, E., et al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).
- Genshaft, A. S., et al. targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction. Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).
- Mahnke, Y. D., Roederer, M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).
- Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).
- Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).
- Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 9 (1), 75 (2017).
