Одноклеточных Quantitation мРНК и поверхности белков в инфицированных Обезьяний вирус иммунодефицита CD4+ T клетки изолированы от макак резус

Summary

Описал представляет собой методологию для quantitate экспрессии генов, 96 и 18 поверхностных белков в одиночных клетках ex vivo, позволяя для идентификации дифференциально выразил генов и белков в инфицированных вирусом клеток по отношению к неинфицированных клеток. Мы применяем подход к изучению SIV-инфицированных CD4⁺ T клетки изолированы от макак резус.

Abstract

Сингл элементный анализ является важным инструментом для рассечения гетерогенной популяции клеток. Выявление и изоляция редких клеток может быть затруднено. Для решения этой задачи, методология сочетания индексируются проточной цитометрии и высок объём мультиплексированных количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР) была разработана. Цель заключалась в выявлении и характеризуют обезьяний иммунодефицита (СИВ)-инфицированные клетки присутствуют в пределах макак резус. Через количественный поверхностных белков путем активации флуоресценции клеток сортируя (FACS) и мРНК, ПЦР инфицированные вирусом клетки определяются выражением вирусных генов, который в сочетании с принимающей генов и белков измерений для создания многомерных профиля . Мы называем подход, целенаправленных одноклеточных Proteo-transcriptional оценки или tSCEPTRE. Для выполнения метода, жизнеспособных клеток запятнаны с флуоресцентных антител специфических для поверхностных маркеров, используемых для изоляции СУИМ подмножества ячеек и/или течению фенотипического анализа. Отдельные ячейки сортируются после немедленного лизиса, мультиплекс обратная транскрипция (RT), предварительно амплификации PCR и ПЦР высокую пропускную способность до 96 стенограмм. СУИМ измерений записываются во время сортировки и впоследствии связан с данными выражения гена хорошо позиции для создания комбинированного белка и транскрипционный анализ профиля. Для изучения SIV-инфицированных клеток непосредственно ex vivo, клетки были определены ПЦР обнаружение нескольких видов вирусной РНК. Сочетание вирусных стенограммы и количество каждого обеспечивают основу для классификации клеток в различных стадиях вирусный жизненного цикла (например, производственной и непроизводственной). Кроме того tSCEPTRE SIV⁺ клеток были по сравнению с неинфицированных клеток, изолированные от же образца для оценки дифференциально выраженной хост генов и белков. Результаты анализа показали ранее непонятыми вирусной РНК выражение гетерогенность среди инфицированных клеток, а также в естественных условиях регулирования SIV-опосредованной post-transcriptional гена с одной ячейкой резолюции. Метод tSCEPTRE является актуальной для анализа любой популяции клеток, поддаются идентификации выражением поверхности белка marker(s), принимающих или патогена gene(s) или их комбинации.

Introduction

Многих внутриклеточных возбудителей полагаются на принимающей ячейки механизма репликации, часто изменяя хост клеточной биологии или ориентация весьма специфические субпопуляции клеток хозяина, чтобы максимизировать шансы распространения. В результате биологические процессы клеток обычно разрушаются, пагубные последствия для общего состояния здоровья хоста. Понимание взаимодействий между вирусами и клеток хозяина, в которых они повторить будет выяснить механизмы заболеваний, которые могут помочь в разработке улучшения лечения и стратегий для предотвращения инфекции. Прямые аналитические инструменты, которые позволяют изучение взаимодействия хост возбудитель важное значение этой цели. Сингл элементный анализ обеспечивает единственным средством однозначно отнести клеточном фенотипу в частности генотип, или инфекции статус¹. К примеру патогенных инфекций часто вызывают прямые и косвенные изменения в клетки хозяина. Таким образом, различие инфицированных клеток от их неинфицированных партнеров необходимо для изменения атрибутов принимающей ячейки прямой инфекции или вторичные эффекты, такие как обобщенные воспаления. Кроме того для многих патогенов, таких как Сив и вирусам иммунодефицита человека (ВИЧ), принимающей ячейки инфекции проходит через несколько этапов, таких как рано, поздно, или скрытая, каждый из которых может характеризоваться отдельных генов и белков выражение профили^{2 , 3 , 4 , 5}. анализ сыпучих смесей клеток удастся захватить это неоднородность⁶. Напротив, весьма мультиплексированных одноклеточных анализирует возможность количественно оценить выражение как вирусный и принимающих гены предлагают средства для устранения инфекции конкретных клеточных возмущений, включая вариации через стадии инфекции. Кроме того анализ взаимодействия хост возбудителя в физиологически соответствующие параметры имеет решающее значение для выявления событий, которые происходят в зараженных организмов. Таким образом методы, которые могут быть применены непосредственно ex vivo , скорее всего, в лучший захват в естественных условиях процессы.

Сив и ВИЧ целевых CD4⁺ T клетки, в которых они противодействовать хост противовирусное «ограничение» факторы и помощью антиген представляющих молекул по созданию продуктивной инфекции и избежать иммунной наблюдения^{7,8, 9,10,11}. Без лечения, инфекция приводит к массовой гибели CD4 клеток⁺ T, в конечном итоге кульминацией приобретенного иммунодефицита (СПИД)¹². В параметре антиретровирусной терапии, скрытно инфицированной клетки водохранилищ сохраняются на протяжении десятилетий, что создает серьезное препятствие для лечебной стратегиями. Понимание свойств в vivo ВИЧ/SIV-инфицированных клеток имеет потенциал раскрыть принимающей ячейки особенности важную роль в патогенезе и настойчивость. Однако это весьма сложным, прежде всего благодаря low frequency инфицированных клеток и нехватка реагентов возможность легко идентифицировать их. Клетки, которые транскрибировать вирусной РНК, оцениваются присутствовать на 0,01 – 1% CD4⁺ T-клеток в крови и лимфоидной ткани^13,14,15. При подавляющей терапии скрытно инфицированные клетки даже реже, 10^-3– 10^{-7 16,17,18}. Вирусных белков пятнать assays, что хорошо работать для изучения в пробирке инфекций, таких как внутриклеточных кляп, субоптимальный вследствие окрашивания фона 0,01 – 0,1%, аналогичные или больше, чем частота инфицированных клеток^{13, 14}. Пятнать поверхности для Env протеина используя хорошо изученных SIV ВИЧ/Env-моноклональные антитела также было доказано быть трудно, вероятно, по тем же причинам. Недавно, Роман инструменты призваны улучшить обнаружение клеток, выражая кляп, либо включения assays для кляп РНК или с помощью альтернативных изображений технологий^14,15,19. Однако такие подходы по-прежнему ограничены в число количественных измерений выполняется для каждой ячейки.

Здесь мы описываем методологии (1) идентифицирует отдельные инфицированные вирусом клетки непосредственно ex vivo чувствительных и конкретных вирусных генов Количественная ПЦР и (2) количественное выражение до 18 поверхностных белков и 96 генов для каждого инфицированных (и неинфицированным) клеток. Эта методология сочетает поверхности белка одноклеточных измерение СУИМ, следуют лизис немедленного клеток и с помощью анализа выражения гена мультиплексированных целевых ПЦР на системе Biomark. Микросхема аэрогидродинамических (МФК) технология позволяет мультиплексированных количественный генов 96 из 96 образцов одновременно, проделанную матрицу 9216 камер, в которых выполняются отдельные ПЦР-реакции. Живой клетки СУИМ Сортировка записей высоким содержанием белка изобилие измерений при сохранении всей транскриптом для анализа сразу же вниз по течению. Для выявления инфицированных вирусом клеток, конкретных анализов для вирусной РНК альтернативно сращивания и unspliced (vRNA), включены в анализ ПЦР, вместе с группой определяемых пользователем анализов, на общую сумму до 96 генов, максимальное количество анализов, в настоящее время размещены в МФК. Экспрессия генов и белков информацию, собранную для каждой ячейки связаны также позиции. Мы сообщалось ранее результаты этого анализа других²⁰. Здесь, мы предоставляем более подробные методологические руководящие принципы, а также дополнительные описательные фенотипирование SIV-инфицированных CD4⁺ T клетки.

Этот подход, который мы называем tSCEPTRE, могут применяться к суспензии любых жизнеспособных клеток населения реактивной дневно обозначенные антитела и выражая транскриптом совместим с доступных ПЦР-анализов. Например она может использоваться для характеристики дифференциальных генов и белков в редких ячейки или ячейки, не легко отличают поверхности белка маркеров. Подготовка образца опирается на стандарт пятнать протокола с использованием коммерчески доступных антител. Цитофлуориметрами с возможностью сортировки одноклеточных коммерчески доступны, но биобезопасности дополнительные меры предосторожности, необходимые для обработки инфекционных живых клеток. Запись одноклеточного белка выражение профиль для каждой ячейки по позиции, а также упомянутые в настоящем документе как индексированных сортировки, является общей чертой всех коммерчески доступных СУИМ, сортировка программного обеспечения. Вычислительный анализ генов дифференциально выраженной хост среди популяции клеток интерес не описано здесь, но ссылки предоставляются для опубликованных ранее методов.

Protocol

Примечание: Схема протокола рабочего процесса показан на рисунке 1. Он состоит из трех основных этапов: СУИМ, RT и предварительно амплификация cDNA и ПЦР для до 96 генов одновременно. Две версии протокола, сортировка клеток в ограничении разведений и сортировка единичных кле…

Representative Results

Рабочий процесс для весь протокол изображен на рисунке 1. Он состоит из двух вариантов определяется количество клеток сортировка: либо ограничивающих разрежения или как одной клетки, как описано в тексте. На рисунке 2приведены примеры а…

Discussion

Протокол описано здесь, называется tSCEPTRE, интегрирует поверхности белка одноклеточных количественный, многопараметрических проточной цитометрии с количественное выражение mRNA одноклеточных, высоко мультиплексированных RT-ПЦР. Объединение этих двух технологий позволяет высоким содер?…

Materials

RNA extraction and PCR reagents and consumables
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate	BioExpress/VWR	T-3060-1
Adhesive PCR Plate Seals	ThermoFisher	AB0558
Armadillo 384-well PCR Plate	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Glass Distilled Water	Teknova	W3345
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
SUPERase-In Rnase Inhibitor	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Reference Dye (if separate from kit)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0223
RNAqueous kit	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Biomark reagents
Control Line Fluid Kit	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000736
Sample Loading Reagent	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS reagents
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Polystyrene tube with strainer cap	FALCON	352235
Aqua Live/Dead stain	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	dilute 1:800
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2	BD Biosciences	563916	dilute 1:40
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200	BD Biosciences	563914	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8	BD Biosciences	564804	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2	Biolegend	302948	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2	BD Biosciences	564710	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2	Biolegend	301842	dilute 1:83
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8	Biolegend	302048	dilute 1:167
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7	Biolegend	302340	dilute 1:37
Anti-CD38-R PE clone OKT10	NHP reagent recource	N/A	dilute 1:100
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50	BD Biosciences	564364	dilute 1:10
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6	BD Biosciences	561358	dilute 1:20
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A	Biolegend	313528	dilute 1:80
Instruments
BioPrptect Containment Enclosure	Baker
BD FACS Aria	BD Biosciences
ProtoFlex Dual 96-well PCR system	Applied Biosystems/ThermoFisher	4484076
Quant Studio 6 qPCR instrument	Applied Biosystems/ThermoFisher	4485694
IFC controller HX	Fluidigm	IFC-HX
Biomark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD