Unicellulaire quantification des ARNm et Expression de protéines de Surface CD4 infectées par le Virus d’immunodéficience simien+ T les cellules isolées de macaques rhésus

Summary

Décrit est une méthodologie pour quantifier l’expression des 96 gènes et 18 protéines de surface de cellules uniques ex vivo, permettant d’identifier de façon différentielle exprimée des gènes et des protéines dans les cellules infectées par le virus par rapport aux cellules non infectées. Nous appliquons la démarche d’étude CD4 infectés par le SIV⁺ T cellules isolées de macaques rhésus.

Abstract

Analyse de cellules individuelles est un important outil de dissection des populations hétérogènes de cellules. L’identification et l’isolement de cellules rares peuvent être difficiles. Pour relever ce défi, une combinaison de méthodologie indexé de cytométrie en flux et haut débit multiplex quantitative PCR (qPCR) a été développé. L’objectif était d’identifier et de caractériser le virus de l’immunodéficience simienne (vis)-infecté les cellules présentes au sein de macaques rhésus. Par dosage de la protéine de surface par un tri de cellule activée par fluorescence (FACS) et de l’ARNm par qPCR, cellules infectées par le virus sont identifiés par l’expression des gènes viraux, qui est combinée avec les mesures de gènes et des protéines hôte pour créer un profil multidimensionnel . Nous appelons l’approche, évaluation unicellulaires Proteo-transcriptional ciblée ou tSCEPTRE. Pour exécuter la méthode, des cellules viables sont colorées avec des anticorps fluorescents spécifiques de marqueurs de surface utilisés pour isoler les FACS d’un sous-ensemble de cellules et/ou d’analyse phénotypique en aval. Cellules individuelles sont triés suivis par lyse immédiate, multiplexe transcription inverse (RT), les pré amplification par PCR et haut débit qPCR de jusqu’à 96 transcrits. Les mesures de FACS sont enregistrées au moment du tri et liés ultérieurement pour les données d’expression de gène en position bien à créer une protéine combinée et le profil transcriptionnel. Pour étudier les infectés par le SIV cellules directement ex vivo, les cellules ont été identifiés par la détection de qPCR de multiples espèces d’ARN virales. La combinaison des transcriptions virales et la quantité de chaque fournissent un cadre pour la classification des cellules en étapes distinctes du cycle de vie viral (p. ex., productives et non productives). En outre, tSCEPTRE des cellules SIV⁺ ont été par rapport à des cellules isolées du même spécimen pour évaluer des protéines et gènes différentiellement exprimés hôtes. L’analyse a révélé précédemment incomprises hétérogénéité d’expression de RNA virale chez les cellules infectées comme in vivo la régulation des gènes post-transcriptionnels induite par le SIV avec résolution unicellulaire. La méthode tSCEPTRE est pertinente pour l’analyse d’une population cellulaire se prête à l’identification par l’expression du marqueur de la protéine de surface, ou des gènes pathogène ou d’un hôte ou une combinaison.

Introduction

De nombreux pathogènes intracellulaires dépendent de machinerie cellulaire hôte à répliquer, souvent modifier la biologie cellulaire hôte ou ciblage très certaines sous-populations de cellules de l’hôte pour maximiser leurs chances de propagation. Ainsi, les processus biologiques de cellule sont communément perturbés, avec des conséquences délétères sur la santé globale de l’hôte. Compréhension des interactions entre les virus et les cellules de l’hôte dans lequel ils répliquent élucidera les mécanismes de la maladie qui pourraient contribuer à l’élaboration de stratégies et d’amélioration des traitements pour prévenir l’infection. Les outils d’analyse directes qui permettent l’étude des interactions hôte-pathogène sont essentiels à cette fin. Analyse de cellule unique fournit le seul moyen d’attribuer sans ambiguïté un phénotype cellulaire à un génotype particulier, ou infection état¹. Par exemple, les infections pathogènes induisent fréquemment des changements tant directes qu’indirectes dans les cellules de l’hôte. Par conséquent, distinguer les cellules infectées de leurs homologues non infectés est nécessaire à l’attribut change de cellule hôte à une infection directe ou des effets secondaires, tels que généralisé l’inflammation. En outre, de nombreux agents pathogènes, tels que SIV et des virus de l’immunodéficience (VIH), infection de cellule hôte procède par étapes multiples, tels que dès le début, fin, ou latente, dont chacun peut être caractérisée par gènes distincts et protein expression profils^{2 , 3 , 4 , 5}. analyses en vrac des mélanges de cellules vont échouer à capturer cette hétérogénéité⁶. En revanche, fortement multiplexés analyses unicellulaires capables de quantifier l’expression des deux virale et gènes hôtes offrent un moyen de résoudre les perturbations cellulaires spécifiques à l’infection, y compris les variations à travers des stades de l’infection. En outre, analyse des interactions hôte-pathogène chez physiologiquement paramètres pertinents est essentiel pour l’identification des événements qui se produisent dans les organismes infectés. Ainsi, les méthodes pouvant être appliquées directement ex vivo sont susceptibles de la meilleure capture en vivo traite.

SIV et VIH cible CD4⁺ T des cellules, dans lesquelles ils lutter contre les facteurs antiviraux « restriction » de l’hôte et atténuent présentatrices d’antigènes molécules afin d’établir une infection productive et éviter la surveillance immunitaire^{7,8, 9,10,11}. Sans traitement, l’infection se traduit par une perte massive de CD4⁺ T cells, finalement sanctionnée par acquis d’immunodéficience (sida)¹². Dans le cadre d’une thérapie antirétrovirale, réservoirs de cellules infectées de façon latente persistent depuis des décennies, posant un obstacle redoutable à stratégies curatives. Comprendre les propriétés de in vivo des cellules infectées par le VIH/SIV a le potentiel pour révéler les caractéristiques des cellules hôte joué un rôle dans la pathogénie et la persistance. Toutefois, cela a été très difficile, en raison surtout de la low frequency des cellules infectées et manque de réactifs capables de les identifier facilement. Les cellules qui transcrivent l’ARN viral, sont estimés à présent à 0,01 – 1 % de CD4 des cellules dans le sang et les tissus lymphoïdes^13,14,15+ T. Sous un traitement suppressif, cellules infectées de façon latente sont encore moins fréquentes à 10^-3-10^{-7 16,17,18}. Coloration de la protéine virale dosages que bien pour l’étude des infections in vitro , par exemple pour des Gag intracellulaire, sont sous-optimaux en raison de la coloration de fond de 0,01 à 0,1 %, similaire ou supérieure à la fréquence des cellules infectées^{13, 14}. Surface de coloration pour protéine Env en utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques au SIV/VIH Env bien caractérisés aussi a été prouvée que sera difficile, probablement pour des raisons similaires. Récemment, les nouveaux outils visent à améliorer la détection des cellules exprimant le Gag soit par intégrant des analyses spécifiques pour gag RNA ou à l’aide de moyens d’imagerie technologies^14,15,19. Cependant, ces approches restent limités dans le nombre de mesures quantitatives effectuées sur chaque cellule.

Nous décrivons ici la méthodologie qui (1) identifie les cellules infectées par le virus directement ex vivo de qPCR quantitative sensible et spécifique des gènes viraux et (2) quantifie l’expression des protéines de surface jusqu’à 18 et 96 gènes pour chaque infecté (et cellules non infectées). Cette méthode combine la mesure de la protéine de surface monocellulaire de FACS, suivie de la lyse cellulaire immédiate et à l’aide de gene expression analyse multiplexés qPCR ciblée sur le système Biomark. La technologie intégrée circuit fluidique (IFC) permet multiplexé dosage des 96 gènes 96 échantillons simultanément, accompli par une matrice de 9 216 chambres dans lesquelles sont effectuées les réactions individuelles qPCR. Le tri des cellules vivantes FACS enregistre les mesures d’abondance haute teneur protéique tout en préservant le transcriptome de tout analyse effectuée immédiatement en aval. Pour identifier les cellules infectées par le virus, dosages spécifiques pour l’ARN viral alternativement épissé et unspliced (vRNA) sont inclus dans l’analyse de qPCR, avec un panel de tests définis par l’utilisateur totalisant jusqu’à 96 gènes, le nombre maximal d’essais actuellement logés dans la SFI. Les l’expression des gènes et les protéines informations collectées pour chaque cellule sont reliées par une position bien. Nous avons déjà indiqué les résultats de cette analyse ailleurs²⁰. Ici, nous fournissons plus d’orientations méthodologiques, mais aussi plus descriptive phénotypage des CD4 infectés par le SIV⁺ T des cellules.

Cette approche, que nous appelons tSCEPTRE, peut être appliquée à des suspensions d’une population de cellules viables réactive anticorps fluorescent étiquetés et exprimant un transcriptome compatible avec des essais de qPCR disponible. Par exemple, il peut être utilisé pour caractériser les gènes différentiel et expression de la protéine dans les cellules rares ou pas facilement distingués par des marqueurs de la protéine de surface des cellules. La préparation de l’échantillon se fonde sur une norme souillant le protocole utilisant des anticorps disponibles dans le commerce. Cytomètres de flux avec capacité de tri unicellulaires sont également disponibles dans le commerce, mais des précautions biosécurité supplémentaires sont nécessaires pour le traitement des cellules vivantes infectieuses. Enregistrer le profil d’expression de protéines monocellulaires pour chaque cellule de position bien, mentionné aux présentes comme indexée tri, est une caractéristique commune des FACS disponibles dans le commerce, logiciel de tri. Analyse computationnelle de gènes différentiellement exprimés hôte parmi les populations de cellules d’intérêt n’est pas décrit ici, mais les références sont fournies aux méthodes publiées antérieurement.

Protocol

Remarque : Un schéma du flux de protocole est illustré à la Figure 1. Il se compose de trois étapes principales : FACS, RT et préamplification ADNc et qPCR jusqu’à 96 gènes simultanément. Deux versions du protocole, tri des cellules en limitant les dilutions et le tri des cellules individuelles, sont décrites en détail dans les étapes 5 et 6, respectivement. Ces stratégies aborder des questions de recherche différents mais suivent des procédures similaires. <p class="jove…

Representative Results

Le flux de travail pour l’ensemble du protocole est représenté dans la Figure 1. Il se compose de deux variations définies par le nombre de cellules triées : chaque dilution limitante ou en tant que simple de cellules, comme décrit dans le texte. Exemples d’apprêt-sonde analyse de qualification sur 2 fois des dilutions sériées de RNA sont indiquées à la Figure 2. La stratégie de blocage pour identifier les éventu…

Discussion

Le protocole décrit ici, appelé tSCEPTRE, intègre le dosage de la protéine de surface monocellulaire par cytométrie multiparamétrique avec l’expression de l’ARNm unicellulaires quantitative par RT-qPCR hautement multiplexé. L’union de ces deux technologies permet à haute teneur instantanés du combiné transcriptionnelles et profil protéique des cellules individuelles dans un format haut débit. Nous utilisons la méthode pour identifier les cellules jusqu’ici insaisissables infectés par le SIV en v…

Materials

RNA extraction and PCR reagents and consumables
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate	BioExpress/VWR	T-3060-1
Adhesive PCR Plate Seals	ThermoFisher	AB0558
Armadillo 384-well PCR Plate	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Glass Distilled Water	Teknova	W3345
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
SUPERase-In Rnase Inhibitor	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Reference Dye (if separate from kit)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0223
RNAqueous kit	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Biomark reagents
Control Line Fluid Kit	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000736
Sample Loading Reagent	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS reagents
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Polystyrene tube with strainer cap	FALCON	352235
Aqua Live/Dead stain	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	dilute 1:800
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2	BD Biosciences	563916	dilute 1:40
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200	BD Biosciences	563914	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8	BD Biosciences	564804	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2	Biolegend	302948	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2	BD Biosciences	564710	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2	Biolegend	301842	dilute 1:83
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8	Biolegend	302048	dilute 1:167
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7	Biolegend	302340	dilute 1:37
Anti-CD38-R PE clone OKT10	NHP reagent recource	N/A	dilute 1:100
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50	BD Biosciences	564364	dilute 1:10
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6	BD Biosciences	561358	dilute 1:20
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A	Biolegend	313528	dilute 1:80
Instruments
BioPrptect Containment Enclosure	Baker
BD FACS Aria	BD Biosciences
ProtoFlex Dual 96-well PCR system	Applied Biosystems/ThermoFisher	4484076
Quant Studio 6 qPCR instrument	Applied Biosystems/ThermoFisher	4485694
IFC controller HX	Fluidigm	IFC-HX
Biomark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD