Encellede kvantitering af mRNA og overflade Protein udtryk i Simian immundefektvirus-inficerede CD4+ T celler isoleret fra Rhesus makakaber
Summary
Beskrevet er en metode til at kvantificere udtryk for 96 gener og 18 overflade proteiner af enkelt celler ex vivo, giver mulighed for identifikation af varierende udtrykte gener og proteiner i virus-inficerede celler i forhold til ikke-inficerede celler. Vi anvender tilgang til undersøgelse SIV-inficerede CD4+ T celler isoleret fra rhesus makakaber.
Abstract
Enkelt-celle analyse er et vigtigt redskab for dissekere heterogene befolkninger af celler. Identifikation og dyrkning af sjældne celler kan være svært. For at overvinde denne udfordring, en metode, der kombinerer indekseret flowcytometri og høj overførselshastighed multipleksede kvantitative polymerase kædereaktion (qPCR) blev udviklet. Formålet var at identificere og karakterisere simian immundefektvirus (SIV)-inficerede celler stede i rhesus makakaber. Gennem kvantitering af overflade proteiner af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) og mRNA af qPCR, er virus-inficerede celler identificeret ved viral genekspression, som er kombineret med værten gen- og protein målinger til at oprette en flerdimensional profil . Vi kalder den tilgang, målrettede encellede Proteo-transcriptional evaluering eller tSCEPTRE. For at udføre metoden, er levedygtige celler farves med fluorescerende antistoffer specifikke for overflade markører, der anvendes til FACS isolation af en celle delmængde og/eller downstream fænotypiske analyser. Enkelt celler er sorteret efterfulgt af umiddelbar lysis, multiplex reverse transkription (RT), PCR pre forstærkning og høj overførselshastighed qPCR af op til 96 udskrifter. FACS målinger registreres på tidspunktet for sortering og senere knyttet til genekspression data af godt stand til at skabe en kombineret protein og transcriptional profil. For at studere SIV-inficerede celler direkte ex vivo, cellerne blev identificeret af qPCR påvisning af flere viral RNA arter. Kombinationen af viral udskrifter og mængden af hvert giver en ramme for klassificering af celler i forskellige stadier af den virale livscyklus (f.eks., produktive kontra ikke-produktive). Desuden var tSCEPTRE af SIV+ celler i forhold til ikke-inficerede celler isoleret fra den samme model, som skal vurdere varierende udtrykt vært gener og proteiner. Analysen viste tidligere miskendte viral RNA udtryk heterogenitet blandt inficerede celler samt i vivo SIV-medieret post-transcriptional gen forordning med enkelt-celle opløsning. Metoden tSCEPTRE er relevante for analysen af enhver celle befolkningens imødekommenhed over for identifikation af udtryk af overflade protein marker(s), vært eller patogen molekylærgenetisk eller kombinationer heraf.
Introduction
Mange intracellulære patogener stole på vært celle maskiner til at replikere, ofte at ændre værten cellebiologi eller rettet mod meget specifikke delpopulationer af værtsceller at maksimere deres chancer for formering. Som et resultat, er celle biologiske processer almindeligt forstyrret, med skadelige konsekvenser for den generelle sundhed i værten. Forstå samspillet mellem virus og værtsceller, hvor de replikere vil belyse sygdomsmekanismer, der kan støtte i udviklingen af forbedrede terapier og strategier til at forhindre infektion. Direkte analytiske værktøjer, der aktiverer undersøgelse af vært-patogen interaktioner er væsentlige mod herpå. Enkelt-celle analyse giver kun mulighed for utvetydigt at tilskrive en cellulær fænotype til en given genotype eller infektion status1. For eksempel, fremkalde patogene infektioner ofte både direkte og indirekte ændringer i værtsceller. Derfor skelne inficerede celler fra deres ikke-inficerede modparter er nødvendige attribut vært celle ændringer enten direkte infektion eller sekundære effekter, såsom generaliseret betændelse. Desuden, for mange patogener, som SIV og human immundefekt virus (HIV), host celle infektion provenuet gennem flere faser, som tidligt, sent, eller latent, hver især kan være kendetegnet ved forskellige gen- og protein udtryk profiler2 , 3 , 4 , 5. bulk analyser af celle blandinger vil undlade at fange denne heterogenitet6. Derimod multipleksede meget encellede analyser at kvantificere udtryk for både virus og vært gener tilbyder et middel til at løse infektion-specifikke cellulære perturbationer, herunder variationer på tværs af infektion faser. Yderligere, analysere vært-patogen interaktioner i fysiologisk relevante indstillinger er kritisk for identifikation af hændelser, der opstår i inficerede organismer. Således er metoder, der kan anvendes direkte ex vivo er sandsynligt, at bedste fange i vivo processer.
SIV og HIV målrette CD4+ T celler, hvor de modvirke vært antiviral “begrænsning” faktorer og nedregulere antigen præsentere molekyler til at skabe produktive infektion og undgå immun overvågning7,8, 9,10,11. Uden behandling, infektionen resulterer i massive tab af CD4 celler,+ T, i sidste ende kulminerede i erhvervet immundefekt syndrom (AIDS)12. I indstillingen i antiretroviral behandling persistere latent inficerede celle reservoirer i årtier, udgør en enorm hindring for helbredende strategier. Forstå egenskaberne for i vivo HIV/SIV-inficerede celler har potentiale til at afsløre vært celle funktioner medvirkende patogenese og vedholdenhed. Men dette har meget udfordrende, primært på grund af low frequency af inficerede celler og mangel på reagenser kunne let identificere dem. Celler, der transskriberer viral RNA, er anslået til at være til stede på 0,01 – 1% af CD4+ T-celler i blodet og lymfoide væv13,14,15. Under undertrykkende terapi er latent inficerede celler endnu mindre hyppige på 10-3– 10-7 16,17,18. Viral protein farvning-undersøgelser, at arbejde godt for at studere in vitro infektioner, såsom intracellulære Gag er suboptimal på grund af baggrunden farvning af 0,01-0,1%, svarende til eller større end hyppigheden af inficerede celler13, 14. Overflade farvning for Env protein af godt karakteriseret SIV/HIV Env-specifikke monoklonale antistoffer har også vist sig for at være vanskelig, sandsynligvis af lignende årsager. For nylig, Roman værktøjer har til formål at forbedre påvisningen af celler, der udtrykker Gag af enten indarbejde undersøgelser vedrørende specifikke for gag RNA eller ved hjælp af alternative tænkelig teknologier14,15,19. Men sådanne tilgange forblive begrænset antal kvantitative målinger udført på hver celle.
Her, vi beskriver metoder, som (1) identificerer enkelt virus-inficerede celler direkte ex vivo af følsom og specifik viral gen kvantitative qPCR og (2) kvantificerer udtryk for op til 18 overflade proteiner og 96 gener for hver inficeret (og uinficerede) celle. Denne metode kombinerer encellede overflade protein måling af FACS efterfulgt af umiddelbar celle lysis og gen expression analyse bruger multipleksede målrettede qPCR på Biomark systemet. Den integrerede fluidic kredsløb (IFC) teknologi tillader multipleksede kvantitering af 96 gener fra 96 prøver samtidig, udført af en matrix af 9,216 kamre, som er udført i de enkelte qPCR reaktioner. Den levende celle FACS sortering registrerer high-indhold protein overflod målinger, mens bevare den hele transkriptom analyse udføres umiddelbart nedstrøms. For at identificere virus-inficerede celler, assays specifikke for alternativt splejset og unspliced viral RNA’er (vRNA) er inkluderet i qPCR analyse, sammen med et panel af brugerdefinerede assays sammentælling op til 96 gener, det maksimale antal assays i øjeblikket indkvarteret i IFC. Genekspression og protein oplysninger indsamles for hver celle er forbundet af godt holdning. Vi har tidligere rapporteret resultaterne fra denne analyse andetsteds20. Her, vi giver mere detaljerede metodologiske retningslinjer samt yderligere beskrivende fænotyper af SIV-inficerede CD4+ T celler.
Denne tilgang, som vi kalder tSCEPTRE, kan anvendes til suspensioner nogen levedygtig celle befolknings reaktiv til fluorescently mærket antistoffer og udtrykke en transkriptom kompatibel med tilgængelige qPCR assays. Det kan for eksempel bruges til kendetegner differential gen- og protein udtryk i sjældne celler eller celler ikke let kendetegnet ved overfladen protein markører. Prøveforberedelsen bygger på en standard farvning protokollen ved hjælp af kommercielt tilgængelige antistoffer. Cytometers med enkelt-celle sortering evne er også kommercielt tilgængelige, men yderligere biosikkerhed forholdsregler er nødvendige for behandling af smitsomme levende celler. Optagelse single – celle protein udtryk profil for hver celle ved godt position, omhandlet heri er som indekseret sortering, en fælles funktion af kommercielt tilgængelige FACS sortering software. Beregningsmæssige analyse af varierende udtrykt vært gener blandt cellepopulationer af interesse er beskrevet ikke her, men referencer leveres til tidligere offentliggjorte metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her, betegnes tSCEPTRE, integrerer én celle overflade protein kvantitering af multiparameter flowcytometri med kvantitative encellede mRNA udtryk af stærkt multipleksede RT-qPCR. Foreningen af disse to teknologier gør det muligt for high-indhold snapshots af den kombinerede transcriptional og protein profil af enkelt celler i et format, høj overførselshastighed. Vi bruger metoden til at identificere forhen undvigende celler inficeret med SIV i vivo, og beskrive varierende udtrykt vært…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke NIAID VRC Flow flowcytometri kerne og MHRP Flow flowcytometri Core faciliteter til vedligeholdelse og drift af FACS instrumenter og sorteringsapparater; Maria Montero, Vishakha Sharma, Kaimei Song for teknisk ekspertbistand; Michael Piatak, Jr. (afdøde) for assistance med SIV qPCR assay design; og Brandon Keele og Matthew Scarlotta for SIV isolere sekvenser. De fremsatte synspunkter er dem af forfatterne og bør ikke fortolkes til at repræsentere positioner i den amerikanske hær eller Department of Defense. Forskning blev udført under en godkendte brug af dyr protokol et AAALAC akkrediteret anlæg i overensstemmelse med den animalsk velfærd opføre og andre føderale love og forskrifter vedrørende dyr og eksperimenter involverer dyr og overholder principperne anført i vejledningen for pleje og brugen af forsøgsdyr, NRC publikation, 2011 udgave.
Materials
|
RNA extraction and PCR reagents and consumables |
|||
|
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate |
BioExpress/VWR |
T-3060-1 |
|
|
Adhesive PCR Plate Seals |
ThermoFisher |
AB0558 |
|
|
Armadillo 384-well PCR Plate |
ThermoFisher |
AB2384 |
|
|
MicroAmp Optical Adhesive Film |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4311971 |
|
|
DEPC Water |
Quality Biological |
351-068-101 |
|
|
Glass Distilled Water |
Teknova |
W3345 |
|
|
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
11732088 |
|
|
SUPERase-In Rnase Inhibitor |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM2696 |
|
|
Platinum Taq |
Invitrogen/ThermoFisher |
10966034 |
|
|
dNTP Mix |
Invitrogen/ThermoFisher |
18427088 |
|
|
ROX Reference Dye (if separate from kit) |
Invitrogen/ThermoFisher |
12223012 |
|
|
DNA Suspension Buffer |
Teknova |
T0223 |
|
|
RNAqueous kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM1931 |
|
|
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 |
|||
|
CD6 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs00198752_m1 |
|
|
TLR3 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs1551078_m1 |
|
|
Biomark reagents |
|||
|
Control Line Fluid Kit |
Fluidigm |
89000021 |
|
|
TaqMan Universal PCR Mix |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4304437 |
|
|
Assay Loading Reagent |
Fluidigm |
85000736 |
|
|
Sample Loading Reagent |
Fluidigm |
85000735 |
|
|
Dynamic Array 96.96 (chip) |
Fluidigm |
BMK-M-96.96 |
|
|
FACS reagents |
|||
|
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) |
Spherotech Inc. |
CMIgP-30-5H |
|
|
CompBeads Anti-Mouse Ig,k |
BD Biosciences |
51-90-9001229 |
|
|
5 ml Polystyrene tube with strainer cap |
FALCON |
352235 |
|
|
Aqua Live/Dead stain |
Invitrogen/ThermoFisher |
L34976 |
dilute 1:800 |
|
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 |
BD Biosciences |
563916 |
dilute 1:40 |
|
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 |
BD Biosciences |
563914 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 |
BD Biosciences |
564804 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 |
Biolegend |
302948 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 |
BD Biosciences |
564710 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 |
Biolegend |
301842 |
dilute 1:83 |
|
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 |
Biolegend |
302048 |
dilute 1:167 |
|
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 |
Biolegend |
302340 |
dilute 1:37 |
|
Anti-CD38-R PE clone OKT10 |
NHP reagent recource |
N/A |
dilute 1:100 |
|
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 |
BD Biosciences |
564364 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 |
BD Biosciences |
561358 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A |
Biolegend |
313528 |
dilute 1:80 |
|
Instruments |
|||
|
BioPrptect Containment Enclosure |
Baker |
||
|
BD FACS Aria |
BD Biosciences |
||
|
ProtoFlex Dual 96-well PCR system |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4484076 |
|
|
Quant Studio 6 qPCR instrument |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4485694 |
|
|
IFC controller HX |
Fluidigm |
IFC-HX |
|
|
Biomark HD |
Fluidigm |
BMKHD-BMKHD |
References
- Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends Genet. 33 (2), 155-168 (2017).
- Pasternak, A. O., Lukashov, V. V., Berkhout, B. Cell-associated HIV RNA: a dynamic biomarker of viral persistence. Retrovirology. 10, 41 (2013).
- Mailler, E., et al. The Life-Cycle of the HIV-1 Gag-RNA Complex. Viruses. 8 (9), (2016).
- Varmus, H. Retroviruses. Science. 240 (4858), 1427-1435 (1988).
- Frankel, A. D., Young, J. A. HIV-1: fifteen proteins and an RNA. Annu Rev Biochem. 67, 1-25 (1998).
- Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391 (1-2), 133-145 (2013).
- Tokarev, A., Guatelli, J. Misdirection of membrane trafficking by HIV-1 Vpu and Nef: Keys to viral virulence and persistence. Cell Logist. 1 (3), 90-102 (2011).
- Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV Restriction Factors and Mechanisms of Evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
- Sugden, S. M., Bego, M. G., Pham, T. N., Cohen, E. A. Remodeling of the Host Cell Plasma Membrane by HIV-1 Nef and Vpu: A Strategy to Ensure Viral Fitness and Persistence. Viruses. 8 (3), 67 (2016).
- Simon, V., Bloch, N., Landau, N. R. Intrinsic host restrictions to HIV-1 and mechanisms of viral escape. Nat Immunol. 16 (6), 546-553 (2015).
- Kirchhoff, F. Immune evasion and counteraction of restriction factors by HIV-1 and other primate lentiviruses. Cell Host Microbe. 8 (1), 55-67 (2010).
- Wigzell, H. Immunopathogenesis of HIV infection. J Acquir Immune Defic Syndr. 1 (6), 559-565 (1988).
- Reynolds, M. R., et al. Ex vivo analysis of SIV-infected cells by flow cytometry. Cytometry A. 77 (11), 1059-1066 (2010).
- Baxter, A. E., et al. Single-Cell Characterization of Viral Translation-Competent Reservoirs in HIV-Infected Individuals. Cell Host Microbe. 20 (3), 368-380 (2016).
- Grau-Exposito, J., et al. A Novel Single-Cell FISH-Flow Assay Identifies Effector Memory CD4+ T cells as a Major Niche for HIV-1 Transcription in HIV-Infected Patients. MBio. 8 (4), (2017).
- Eriksson, S., et al. Comparative analysis of measures of viral reservoirs in HIV-1 eradication studies. PLoS Pathog. 9 (2), e1003174 (2013).
- Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
- Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nat Med. 15 (8), 893-900 (2009).
- DeMaster, L. K., et al. A Subset of CD4/CD8 Double-Negative T Cells Expresses HIV Proteins in Patients on Antiretroviral Therapy. J Virol. 90 (5), 2165-2179 (2015).
- Bolton, D. L., et al. Combined single-cell quantitation of host and SIV genes and proteins ex vivo reveals host-pathogen interactions in individual cells. PLoS Pathog. 13 (6), e1006445 (2017).
- Quintans, J., Lefkovits, I. Precursor cells specific to sheep red cells in nude mice. Estimation of frequency in the microculture system. Eur J Immunol. 3 (7), 392-397 (1973).
- Finak, G., et al. MAST: a flexible statistical framework for assessing transcriptional changes and characterizing heterogeneity in single-cell RNA sequencing data. Genome Biol. 16, 278 (2015).
- McDavid, A., et al. Modeling bi-modality improves characterization of cell cycle on gene expression in single cells. PLoS Comput Biol. 10 (7), e1003696 (2014).
- McDavid, A., Finak, G., Gottardo, R. The contribution of cell cycle to heterogeneity in single-cell RNA-seq data. Nat Biotechnol. 34 (6), 591-593 (2016).
- Kok, Y. L., Ciuffi, A., Metzner, K. J. Unravelling HIV-1 Latency, One Cell at a Time. Trends Microbiol. , (2017).
- Rato, S., Golumbeanu, M., Telenti, A., Ciuffi, A. Exploring viral infection using single-cell sequencing. Virus Res. 239, 55-68 (2017).
- Wagner, A., Regev, A., Yosef, N. Revealing the vectors of cellular identity with single-cell genomics. Nat Biotechnol. 34 (11), 1145-1160 (2016).
- Nestorowa, S., et al. A single-cell resolution map of mouse hematopoietic stem and progenitor cell differentiation. Blood. 128 (8), e20-e31 (2016).
- Soh, K. T., et al. Simultaneous, Single-Cell Measurement of Messenger RNA, Cell Surface Proteins, and Intracellular Proteins. Curr Protoc Cytom. 75, 41-47 (2016).
- Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-212 (2015).
- Stahlberg, A., Thomsen, C., Ruff, D., Aman, P. Quantitative PCR analysis of DNA, RNAs, and proteins in the same single cell. Clin Chem. 58 (12), 1682-1691 (2012).
- Assarsson, E., et al. Homogenous 96-plex PEA immunoassay exhibiting high sensitivity, specificity, and excellent scalability. PLoS One. 9 (4), e95192 (2014).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20 (5), 473-477 (2002).
- Genshaft, A. S., et al. targeted profiling of single-cell proteomes and transcriptomes in a single reaction. Genome Biol. 17 (1), 188 (2016).
- Mahnke, Y. D., Roederer, M. Optimizing a multicolor immunophenotyping assay. Clin Lab Med. 27 (3), 469-485 (2007).
- Liang, C., Hu, J., Russell, R. S., Kameoka, M., Wainberg, M. A. Spliced human immunodeficiency virus type 1 RNA is reverse transcribed into cDNA within infected cells. AIDS Res Hum Retroviruses. 20 (2), 203-211 (2004).
- Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nat Rev Genet. 16 (3), 133-145 (2015).
- Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Curr Opin Biotechnol. 23 (1), 83-88 (2012).
- Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med. 9 (1), 75 (2017).
