Simian इम्यूनो वायरस में mRNA और सतह प्रोटीन अभिव्यक्ति की एकल-कोशिका Quantitation-संक्रमित CD4+ टी कोशिकाओं को रीसस मकाक से पृथक कर
Summary
वर्णित एक पद्धति है ९६ जीन और 18 एकल कोशिकाओं के द्वारा सतह प्रोटीन की अभिव्यक्ति quantitate पूर्व vivo, विभेदक व्यक्त जीन और अप्रभावित कोशिकाओं के सापेक्ष वायरस संक्रमित कोशिकाओं में प्रोटीन की पहचान के लिए अनुमति देता है । हम SIV-संक्रमित CD4+ टी कोशिकाओं रीसस मकाक से अलग अध्ययन करने के लिए दृष्टिकोण लागू होते हैं ।
Abstract
एकल सेल विश्लेषण कोशिकाओं की विषम आबादी विदारक के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । दुर्लभ कोशिकाओं की पहचान और अलगाव मुश्किल हो सकता है । इस चुनौती को दूर करने के लिए, एक पद्धति के संयोजन अनुक्रमित प्रवाह cytometry और उच्च प्रवाह मल्टीप्लेक्स मात्रात्मक पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qPCR) विकसित किया गया था । उद्देश्य की पहचान करने और simian इम्यूनो वायरस (SIV) की विशेषता थी-रीसस मकाक के भीतर मौजूद संक्रमित कोशिकाओं. प्रतिदीप्ति द्वारा सतह प्रोटीन के quantitation के माध्यम से-सक्रिय कोशिका छँटाई (FACS) और mRNA द्वारा qPCR, वायरस संक्रमित कोशिकाओं वायरल जीन अभिव्यक्ति, जो मेजबान जीन और प्रोटीन माप के साथ संयुक्त है एक बहुआयामी प्रोफ़ाइल बनाने के द्वारा की पहचान कर रहे हैं . हम दृष्टिकोण, लक्षित एकल सेल Proteo-transcriptional मूल्यांकन, या tSCEPTRE । विधि प्रदर्शन करने के लिए, व्यवहार्य कोशिकाओं फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी एक सेल सबसेट और/या बहाव phenotypic विश्लेषण के FACS अलगाव के लिए इस्तेमाल सतह मार्करों के लिए विशिष्ट के साथ दाग रहे हैं । एकल कोशिकाओं को तत्काल lysis, मल्टीप्लेक्स रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी), पीसीआर पूर्व प्रवर्धन, और ९६ टेप तक का उच्च प्रवाह qPCR के बाद हल कर रहे हैं । FACS माप छंटाई के समय में दर्ज की गई है और बाद में अच्छी तरह से एक संयुक्त प्रोटीन और transcriptional प्रोफ़ाइल बनाने की स्थिति से जीन अभिव्यक्ति डेटा से जुड़े । SIV-संक्रमित कोशिकाओं सीधे पूर्व vivoका अध्ययन करने के लिए, कोशिकाओं कई वायरल आरएनए प्रजातियों का पता लगाने qPCR द्वारा की पहचान की गई. वायरल टेप के संयोजन और प्रत्येक की मात्रा वायरल जीवन चक्र के विभिंन चरणों में कोशिकाओं को वर्गीकृत करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान (उदा, उत्पादक बनाम गैर उत्पादक) । इसके अलावा, SIV के tSCEPTRE+ कोशिकाओं को एक ही नमूना से पृथक करने के लिए विभेदक व्यक्त की मेजबान जीन और प्रोटीन का आकलन करने के लिए संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में थे । विश्लेषण से पता चला पहले की सराहना की वायरल आरएनए अभिव्यक्ति संक्रमित कोशिकाओं के बीच विविधता के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक सेल संकल्प के साथ vivo SIV-मध्यस्थता पोस्ट-transcriptional जीन विनियमन में . tSCEPTRE विधि किसी भी सेल सतह प्रोटीन मार्कर (ओं), मेजबान या रोगज़नक़ जीन (एस), या तत्संबंधी संयोजन की अभिव्यक्ति द्वारा पहचान के लिए उत्तरदाई जनसंख्या के विश्लेषण के लिए प्रासंगिक है ।
Introduction
कई intracellular रोगजनकों प्रतिकृति करने के लिए मेजबान सेल मशीनरी पर निर्भर करते हैं, अक्सर मेजबान सेल जीवविज्ञान फेरबदल या मेजबान कोशिकाओं के बहुत विशिष्ट उपआबादी लक्ष्यीकरण को अपने प्रचार के अवसरों को अधिकतम करने के लिए । नतीजतन, सेल जैविक प्रक्रियाओं सामांयतः मेजबान के समग्र स्वास्थ्य के लिए बचके परिणामों के साथ, बाधित कर रहे हैं । वायरस और मेजबान कोशिकाओं में वे स्पष्ट रोग तंत्र है कि बेहतर चिकित्सा और रणनीतियों के संक्रमण को रोकने के विकास में सहायता कर सकते है दोहराने के बीच बातचीत को समझना । प्रत्यक्ष विश्लेषणात्मक उपकरण है कि मेजबान के अध्ययन-रोगज़नक़ बातचीत सक्षम इस अंत की ओर आवश्यक हैं । एकल-कक्ष विश्लेषण किसी विशेष जीनोटाइप, या संक्रमण स्थिति1के लिए एक सेलुलर phenotype को स्पष्ट रूप से एट्रिब्यूट करने का एकमात्र साधन प्रदान करता है. उदाहरण के लिए, रोगजनक संक्रमण अक्सर होस्ट कक्षों में प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष दोनों परिवर्तन पैदा करते हैं । इसलिए, उनके संक्रमित समकक्षों से संक्रमित कोशिकाओं को भेद करने के लिए या तो प्रत्यक्ष संक्रमण या द्वितीयक प्रभाव, जैसे सामान्यीकृत सूजन के लिए मेजबान सेल परिवर्तन विशेषता के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, कई रोगजनकों के लिए, जैसे SIV और मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी), कई चरणों के माध्यम से मेजबान सेल संक्रमण आय, जैसे जल्दी, देर से, या अव्यक्त, जिनमें से प्रत्येक विशिष्ट जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल2 द्वारा विशेषता हो सकती है , 3 , 4 , 5. सेल मिश्रण के थोक विश्लेषण इस विविधता6पर कब्जा करने में विफल हो जाएगा । इसके विपरीत, उच्च मल्टीप्लेक्स एकल सेल विश्लेषण के लिए दोनों वायरल और मेजबान जीन की अभिव्यक्ति का अंदाजा लगाने में सक्षम एक संक्रमण-विशिष्ट सेलुलर perturbations, संक्रमण चरणों में बदलाव सहित समाधान के लिए एक साधन प्रदान करते हैं । इसके अलावा, विश्लेषण मेजबान-शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेटिंग्स में रोगज़नक़ बातचीत संक्रमित जीवों में होने वाली घटनाओं की पहचान के लिए महत्वपूर्ण है । इस प्रकार, सीधे वीवो पूर्व लागू किया जा सकता है कि तरीके vivo प्रक्रियाओं में सबसे अच्छा कब्जा करने की संभावना है ।
SIV और एचआईवी लक्ष्य CD4+ टी कोशिकाओं, जिसमें वे मेजबान एंटीवायरल “प्रतिबंध” कारकों और downregulate प्रतिजन पेश अणुओं उत्पादक संक्रमण स्थापित करने के लिए और प्रतिरक्षा निगरानी7,8से बचने के प्रभावहीन, 9,10,11. उपचार के बिना, CD4+ टी कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर नुकसान में संक्रमण के परिणाम, अंततः अधिग्रहीत इम्यूनो सिंड्रोम (एड्स)12में समापन । एंटीरेट्रोवाइरल चिकित्सा की स्थापना में, अव्यक्त रूप से संक्रमित सेल जलाशयों दशकों के लिए जारी रहती है, उपचारात्मक रणनीतियों के लिए एक दुर्जेय बाधा खड़ी । vivo एचआईवी/SIV-संक्रमित कोशिकाओं में के गुणों को समझना मेजबान सेल रोगजनन और हठ में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई सुविधाओं को प्रकट करने की क्षमता है । हालांकि, यह किया गया है अत्यधिक चुनौतीपूर्ण, मुख्य रूप से संक्रमित कोशिकाओं और आसानी से उन्हें पहचान करने में सक्षम रिएजेंट की कमी की कम आवृत्ति के कारण. कोशिकाओं है कि वायरल आरएनए टाइप, 0.01 पर मौजूद होने का अनुमान है – CD4+ टी कोशिकाओं के रक्त में 1% और लसीकावत् ऊतक13,14,15. दमन चिकित्सा के तहत, अव्यक्त रूप से संक्रमित कोशिकाओं को भी कम कर रहे है पर लगातार 10-3-10-7 16,17,18। वायरल प्रोटीन धुंधला परख है कि इस तरह के intracellular चुप के लिए के रूप में इन विट्रो संक्रमण, में अध्ययन के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, 0.01 के धुंधला पृष्ठभूमि के कारण-0.1%, के समान या अधिक संक्रमित कोशिकाओं की आवृत्ति13की तुलना में इष्टतम हैं, 14. अच्छी तरह से विशेषता SIV/एचआईवी Env-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग कर Env प्रोटीन के लिए सतह धुंधला भी मुश्किल हो गया है, इसी तरह के कारणों के लिए संभावना साबित किया गया है । हाल ही में, उपंयास उपकरण का उद्देश्य या तो चुप झूठ आरएनए के लिए विशिष्ट परख शामिल द्वारा या वैकल्पिक इमेजिंग प्रौद्योगिकियों14,15,19का उपयोग करके चुप व्यक्त कोशिकाओं का पता लगाने में सुधार करने के लिए । हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण प्रत्येक कोशिका पर प्रदर्शन मात्रात्मक माप की संख्या में सीमित रहते हैं ।
यहां, हम पद्धति का वर्णन है कि (1) एकल वायरस संक्रमित कोशिकाओं को पहचानता है सीधे पूर्व संवेदनशील और विशिष्ट वायरल जीन मात्रात्मक qPCR द्वारा vivo और (2) quantifies की अभिव्यक्ति के लिए 18 सतह प्रोटीन और ९६ जीन के लिए प्रत्येक संक्रमित (और अनसंक्रमित) सेल. इस पद्धति FACS द्वारा तत्काल सेल lysis और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के द्वारा पीछा किया एकल सेल सतह प्रोटीन मापन को जोड़ती है, पर मल्टीप्लेक्स लक्षित qPCR का उपयोग कर के निशान प्रणाली । एकीकृत द्रव सर्किट (IFC) प्रौद्योगिकी एक साथ ९६ नमूनों से ९६ जीन के मल्टीप्लेक्स quantitation की अनुमति देता है, ९,२१६ कक्षों जिसमें व्यक्तिगत qPCR प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन कर रहे है की एक मैट्रिक्स द्वारा पूरा किया । लाइव सेल FACS छंटाई रिकॉर्ड उच्च सामग्री प्रोटीन बहुतायत माप है, जबकि विश्लेषण के लिए पूरे transcriptome के संरक्षण के तुरंत बहाव का प्रदर्शन किया । वायरस की पहचान करने के लिए संक्रमित कोशिकाओं, परख वैकल्पिक रूप से ब्याह और ब्याह वायरल RNAs (vRNA) के लिए विशिष्ट qPCR विश्लेषण में शामिल हैं, उपयोगकर्ता के एक पैनल के साथ-९६ जीन को totaling परख परिभाषित, परख वर्तमान में समायोजित की अधिकतम संख्या IFC । जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन प्रत्येक कोशिका के लिए एकत्र की जानकारी अच्छी तरह से स्थिति से जुड़े हुए हैं । हम पहले से इस विश्लेषण से परिणाम की सूचना दी20कहीं । यहां, हम और अधिक विस्तृत methodological दिशानिर्देश प्रदान करते है और साथ ही साथ SIV-संक्रमित CD4+ टी कोशिकाओं के phenotyping वर्णनात्मक ।
यह दृष्टिकोण है, जो हम शब्द tSCEPTRE, किसी भी व्यवहार्य सेल के निलंबन के लिए लागू किया जा सकता है फ्लोरोसेंट लेबल के लिए प्रतिक्रियाशील और उपलब्ध qPCR परख के साथ संगत transcriptome व्यक्त की आबादी । उदाहरण के लिए, यह दुर्लभ कोशिकाओं या सतह प्रोटीन मार्करों द्वारा आसानी से प्रतिष्ठित नहीं कोशिकाओं में निस्र्पक अंतर जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । नमूना तैयारी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग कर एक मानक दाग प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है । एकल सेल छंटाई क्षमता के साथ Cytometers भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन अतिरिक्त सुरक्षा सावधानियों संक्रामक जीवित कोशिकाओं प्रसंस्करण के लिए आवश्यक हैं । रिकॉर्डिंग एकल सेल अच्छी तरह से प्रत्येक कोशिका के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, अनुक्रमित छंटाई के रूप में यहां निर्दिष्ट, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध FACS छँटाई सॉफ्टवेयर की एक आम सुविधा है । गणना के ब्याज की कोशिका आबादी के बीच विभेदक व्यक्त की मेजबान जीन का विश्लेषण यहां वर्णित नहीं है, लेकिन संदर्भ पहले प्रकाशित तरीकों को प्रदान की जाती हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल यहां वर्णित है, tSCEPTREed, एकल-सेल सतह प्रोटीन quantitation द्वारा मात्रात्मक एकल सेल mRNA अभिव्यक्ति के साथ multiparameter प्रवाह cytometry द्वारा एकीकृत उच्च मल्टीप्लेक्स आरटी-qPCR । इन दोनों प्रौद्योगिकियों के संघ उच्च-प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों NIAID VRC प्रवाह Cytometry कोर और Cytometry उपकरणों और छँटाई उपकरणों के रखरखाव और संचालन के लिए MHRP प्रवाह FACS कोर सुविधाओं का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा; मारिया Montero, विशाखा शर्मा, विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Kaimei गीत; माइकल Piatak, जूनियर (मृतक) SIV qPCR परख डिजाइन के साथ सहायता के लिए; और ब्रेंडन कील और मैथ्यू Scarlotta SIV अलग दृश्यों के लिए । व्यक्त विचार लेखकों के हैं और अमेरिकी सेना या रक्षा विभाग के पदों का प्रतिनिधित्व करने के लिए नहीं लगाया जाना चाहिए. पशु कल्याण अधिनियम के अनुपालन में एक AAALAC मान्यता प्राप्त सुविधा में एक अनुमोदित पशु उपयोग प्रोटोकॉल के तहत अनुसंधान आयोजित किया गया था और अन्य संघीय क़ानूनों और जानवरों को शामिल करने और प्रयोगों से संबंधित नियमों और सिद्धांतों का पालन करता है देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं, एनआरसी प्रकाशन, २०११ संस्करण के उपयोग के लिए गाइड में कहा गया है ।
Materials
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RNA extraction and PCR reagents and consumables |
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Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate |
BioExpress/VWR |
T-3060-1 |
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Adhesive PCR Plate Seals |
ThermoFisher |
AB0558 |
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Armadillo 384-well PCR Plate |
ThermoFisher |
AB2384 |
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MicroAmp Optical Adhesive Film |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4311971 |
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DEPC Water |
Quality Biological |
351-068-101 |
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Glass Distilled Water |
Teknova |
W3345 |
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Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
11732088 |
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|
SUPERase-In Rnase Inhibitor |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM2696 |
|
|
Platinum Taq |
Invitrogen/ThermoFisher |
10966034 |
|
|
dNTP Mix |
Invitrogen/ThermoFisher |
18427088 |
|
|
ROX Reference Dye (if separate from kit) |
Invitrogen/ThermoFisher |
12223012 |
|
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DNA Suspension Buffer |
Teknova |
T0223 |
|
|
RNAqueous kit |
Invitrogen/ThermoFisher |
AM1931 |
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TaqMan gene expression assays not listed in Table 2 |
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CD6 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs00198752_m1 |
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TLR3 |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
Hs1551078_m1 |
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|
Biomark reagents |
|||
|
Control Line Fluid Kit |
Fluidigm |
89000021 |
|
|
TaqMan Universal PCR Mix |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4304437 |
|
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Assay Loading Reagent |
Fluidigm |
85000736 |
|
|
Sample Loading Reagent |
Fluidigm |
85000735 |
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Dynamic Array 96.96 (chip) |
Fluidigm |
BMK-M-96.96 |
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FACS reagents |
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SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda) |
Spherotech Inc. |
CMIgP-30-5H |
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|
CompBeads Anti-Mouse Ig,k |
BD Biosciences |
51-90-9001229 |
|
|
5 ml Polystyrene tube with strainer cap |
FALCON |
352235 |
|
|
Aqua Live/Dead stain |
Invitrogen/ThermoFisher |
L34976 |
dilute 1:800 |
|
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2 |
BD Biosciences |
563916 |
dilute 1:40 |
|
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200 |
BD Biosciences |
563914 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8 |
BD Biosciences |
564804 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2 |
Biolegend |
302948 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2 |
BD Biosciences |
564710 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2 |
Biolegend |
301842 |
dilute 1:83 |
|
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8 |
Biolegend |
302048 |
dilute 1:167 |
|
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7 |
Biolegend |
302340 |
dilute 1:37 |
|
Anti-CD38-R PE clone OKT10 |
NHP reagent recource |
N/A |
dilute 1:100 |
|
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50 |
BD Biosciences |
564364 |
dilute 1:10 |
|
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6 |
BD Biosciences |
561358 |
dilute 1:20 |
|
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A |
Biolegend |
313528 |
dilute 1:80 |
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Instruments |
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BioPrptect Containment Enclosure |
Baker |
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BD FACS Aria |
BD Biosciences |
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ProtoFlex Dual 96-well PCR system |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4484076 |
|
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Quant Studio 6 qPCR instrument |
Applied Biosystems/ThermoFisher |
4485694 |
|
|
IFC controller HX |
Fluidigm |
IFC-HX |
|
|
Biomark HD |
Fluidigm |
BMKHD-BMKHD |
References
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