Encellede kvantifisering av mRNA og overflaten Protein uttrykk i Simian immunsvikt-Virus-infiserte CD4+ T celler isolert fra Rhesus aper

Summary

Beskrevet er en metode for å quantitate uttrykket av 96 gener 18 overflaten proteiner av enkeltceller ex vivo, tillater for identifikasjon av ulikt uttrykt gener og proteiner i virus-infiserte celler i forhold til uninfected celler. Vi bruker tilnærming til studiet SIV-infiserte CD4⁺ T celler isolert fra rhesus aper.

Abstract

Én celle analyse er et viktig verktøy for dissekere heterogene bestander av celler. Identifisering og isolering av sjeldne celler kan være vanskelig. For å overvinne denne utfordringen, en metodikk kombinere indeksert flowcytometri og høy gjennomstrømming multiplex kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) ble utviklet. Målet var å identifisere og karakterisere simian immunsviktvirus (SIV)-infiserte celler innenfor rhesus aper. Gjennom kvantifisering av overflaten protein av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) og mRNA av qPCR identifiseres virus-infiserte celler av viral genuttrykk, som er kombinert med verten genet og protein mål å opprette en flerdimensjonal profil . Vi kaller det tilnærming, målrettet encellede BG-transcriptional evaluering eller tSCEPTRE. For å utføre metoden, er levedyktige cellers farget med fluorescerende antistoffer spesifikke for overflate markører brukes for FACS isolering av en celle delsett og/eller nedstrøms fenotypiske analyse. Enkeltceller sorteres etterfulgt av umiddelbar lysis, multiplex omvendt transkripsjon (RT), PCR pre forsterkning og høy gjennomstrømning qPCR av opptil 96 transkripsjoner. FACS målinger registreres ved sortering og senere knyttet til den genuttrykk data av godt posisjon til å skape en kombinert protein og transcriptional profil. Å studere SIV-infiserte celler direkte ex vivo, cellene ble identifisert ved qPCR deteksjon av flere viral RNA arter. Kombinasjonen av viral utskrifter og antallet av hver gir en ramme for klassifisering celler i forskjellige stadier av viral levetid (f.eksproduktiv versus ikke-produktive). Videre var tSCEPTRE av SIV⁺ celler sammenlignet med infisert celler isolert fra samme prøven å vurdere ulikt uttrykt vert gener og proteiner. Analysen avdekket tidligere verdsatt viral RNA uttrykk heterogenitet blant infiserte celler så vel som i vivo SIV-mediert post-transcriptional gene regulering med encellede oppløsning. Metoden tSCEPTRE er relevant for analyse av noen celle befolkningen mottakelig for identifikasjon av uttrykk av overflaten protein marker(s), vert eller patogen gene(s) eller kombinasjoner av disse.

Introduction

Mange intracellulær patogener stole på verten celle maskiner å gjenskape, ofte endre vert cellebiologi eller målretting svært spesifikke subpopulasjoner av verten cellene å maksimere sine sjanser til overføring. Som et resultat, er celle biologiske prosesser ofte forstyrret, med skadelige konsekvenser for den generelle tilstanden til verten. Forstå samspillet mellom virus og verten cellene der de gjenskape vil belyse sykdom mekanismer som kan hjelpe til utvikling av bedre behandlinger og strategier å hindre infeksjon. Direkte analytisk verktøy som muliggjør studiet av vert-patogen interaksjoner er avgjørende mot dette formål. Én celle analyse er den eneste å entydig tillegge en mobilnettet fenotypen til bestemt genotype eller infeksjon status¹. For eksempel skape patogene infeksjoner ofte både direkte og indirekte vertsceller. Derfor skille infiserte celler fra sine infisert kolleger er nødvendig å attributtendringer verten celle direkte infeksjon eller sekundære effekter, eksempel generalisert betennelse. Videre, for mange patogener, som SIV og humant immunsvikt-virus (HIV), verten celle infeksjon går gjennom flere faser, som tidlig, sent, eller latente, hver kan være preget av forskjellige gene og protein uttrykk profiler^{2 , 3 , 4 , 5}. bulk analyser av cellen blandinger mislykkes å fange denne heterogene⁶. Derimot multiplekset svært encellede analyser kunne kvantifisere uttrykk for både virus og vert tilblivelse tilbud en betyr å løse infeksjon-spesifikke mobilnettet forstyrrelser, inkludert variasjoner over infeksjon stadier. Videre analysere vert-patogen interaksjoner i fysiologisk relevante innstillinger er avgjørende for identifikasjon av hendelser som forekommer i infiserte organismer. Dermed metoder som kan brukes direkte ex vivo er trolig best fange i vivo prosesser.

SIV og HIV målrette CD4⁺ T celler, som de motvirke vert antiviral “begrensning” faktorer og downregulate antigen presentere molekyler å etablere produktiv infeksjon og unngå immun overvåking^{7,8, 9,10,11}. Uten behandling, infeksjonen resulterer i enorme tap av CD4⁺ T celler, til slutt kulminerte i ervervet immunodeficiency syndrome (AIDS)¹². I innstillingen av antiretroviral terapi vedvare latently infiserte cellen reservoarer i flere tiår, poserer en formidabel barriere til helbredende strategier. Forstå egenskapene i vivo HIV/SIV-infiserte celler har potensial til å avsløre verten celle funksjoner i patogenesen og utholdenhet. Men har dette vært meget utfordrende, hovedsakelig på grunn av low frequency av infiserte celler og mangel på reagenser kan lett identifisere dem. Celler som transkribere viral RNA, er anslått til å være tilstede på 0,01 – 1% av CD4⁺ T celler i blodet og lymfoidvev^13,14,15. Under undertrykkende terapi er latently infiserte celler enda sjeldnere 10^-3– 10^{-7 16,17,18}. Viral protein flekker søk som brukes til å studere i vitro infeksjoner, slik som for intracellulær Gag, er suboptimal på grunn av bakgrunnen flekker 0,01-0,1%, lik eller større enn hyppigheten av infiserte celler^{13, 14}. Overflate flekk for konv protein bruker godt karakterisert SIV/HIV konv-spesifikke monoklonale antistoffer har også vist seg for å være vanskelig, trolig av lignende grunner. Nylig romanen verktøy mål å forbedre gjenkjenning av celler som uttrykker Gag enten omfatter søk bestemt for kneble RNA eller ved å bruke alternative bildebehandling teknologier^14,15,19. Men disse forbli begrenset i antall kvantitative mål utføres på hver celle.

Her beskriver vi metodikk som (1) identifiserer enkelt virus-infiserte celler direkte ex vivo av sensitiv og bestemt viral genet kvantitative qPCR og (2) kvantifiserer uttrykk for opptil 18 overflaten proteiner og 96 gener for hver infisert (og infisert) cellen. Denne metodikken kombinerer encellede overflaten protein måling av FACS etterfulgt av umiddelbar celle lyse og gene expression analyse bruker multiplekset målrettet qPCR på Biomark systemet. Integrert fluidic krets (IFC) teknologien tillater multiplex kvantifisering av 96 gener fra 96 prøver samtidig ved en matrise av 9,216 kamre som individuelle qPCR reaksjonene utføres. Levende celle FACS sorteringen registrerer høyt innhold protein overflod mål mens bevare det hele transcriptome for analyse utført umiddelbart nedstrøms. Identifisere virus-infiserte celler, analyser bestemt alternativt skjøtes og unspliced viral RNAs (vRNA) er inkludert i qPCR analyse, sammen med et panel av brukerdefinerte analyser totalt opptil 96 gener, maksimalt antall analyser er innkvartert i IFC. Genuttrykk og protein-informasjon som er samlet for hver celle er knyttet av godt posisjon. Vi har tidligere rapportert resultater fra denne analysen andre steder²⁰. Her gir vi mer detaljert metodiske retningslinjene samt ytterligere beskrivende phenotyping av SIV-infiserte CD4⁺ T celler.

Denne tilnærmingen, som vi kaller tSCEPTRE, kan brukes av suspensjon av noen levedyktig celle befolkningen reaktiv til fluorescently merket antistoffer og uttrykke en transcriptome kompatibel med tilgjengelig qPCR analyser. Det kan for eksempel brukes for å karakterisere differensial gene og protein uttrykk i sjeldne celler eller celler som ikke lett skilles ved overflaten protein. Eksempel utarbeidelsen er avhengig av en standard flekker kommersielt tilgjengelig antistoffer-protokoll. Cytometers med én celle sortering evnen er også kommersielt tilgjengelig, men flere biosikkerhet forholdsregler er nødvendige for behandling smittsomme lever celler. Innspillingen single – cellen protein uttrykk profilen for hver celle av godt posisjon, referert til heretter er som indeksert sortering, en vanlig funksjon i kommersielt tilgjengelig FACS sortering programvare. Beregningsorientert analyse av ulikt uttrykt vert gener blant celle populasjoner av interesse er ikke beskrevet her, men referanser tilbys til tidligere publiserte metoder.

Protocol

Merk: En skjematisk av protokollen arbeidsflyten er vist i figur 1. Det består av tre viktigste trinn: FACS, RT og cDNA før forsterkning og qPCR for opptil 96 gener samtidig. To versjoner av protokollen, sortere celler i begrense fortynninger og sortering enkeltceller, er beskrevet nærmere i trinn 5 og 6, henholdsvis. Disse strategiene adresse ulike problemstillinger, men Følg lignende fremgangsmåter. 1. forutsetning eller tidligere analyser Valider…

Representative Results

Arbeidsflyten for hele protokollen er avbildet i figur 1. Det består av to varianter som er definert av antall celler sortert: enten begrensende fortynning eller som enkelt celler, som beskrevet i teksten. Eksempler på primer-sonden kvalifisering analyser på 2-fold føljetong RNA fortynninger vises i figur 2. Gating strategien for å identifisere potensielle SIV+ celler vises i Figur 3….

Discussion

Protokollen beskrevet her, kalt tSCEPTRE, integrerer encellede overflaten protein kvantifisering av multiparameter flowcytometri med kvantitative encellede mRNA uttrykk av meget multiplex RT-qPCR. Unionen av disse to teknologiene kan høyt innhold øyeblikksbilder av den kombinerte transcriptional og protein profilen til enkeltceller i et format som høy gjennomstrømming. Vi bruker metoden til å identifisere hittil unnvikende celler infisert med SIV i vivo, og Beskriv ulikt uttrykt vert gener og proteiner. Pro…

Materials

RNA extraction and PCR reagents and consumables
Genemate 96-Well Semi-Skirted PCR Plate	BioExpress/VWR	T-3060-1
Adhesive PCR Plate Seals	ThermoFisher	AB0558
Armadillo 384-well PCR Plate	ThermoFisher	AB2384
MicroAmp Optical Adhesive Film	Applied Biosystems/ThermoFisher	4311971
DEPC Water	Quality Biological	351-068-101
Glass Distilled Water	Teknova	W3345
Superscript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen/ThermoFisher	11732088
SUPERase-In Rnase Inhibitor	Invitrogen/ThermoFisher	AM2696
Platinum Taq	Invitrogen/ThermoFisher	10966034
dNTP Mix	Invitrogen/ThermoFisher	18427088
ROX Reference Dye (if separate from kit)	Invitrogen/ThermoFisher	12223012
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0223
RNAqueous kit	Invitrogen/ThermoFisher	AM1931
TaqMan gene expression assays not listed in Table 2
CD6	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs00198752_m1
TLR3	Applied Biosystems/ThermoFisher	Hs1551078_m1
Biomark reagents
Control Line Fluid Kit	Fluidigm	89000021
TaqMan Universal PCR Mix	Applied Biosystems/ThermoFisher	4304437
Assay Loading Reagent	Fluidigm	85000736
Sample Loading Reagent	Fluidigm	85000735
Dynamic Array 96.96 (chip)	Fluidigm	BMK-M-96.96
FACS reagents
SPHERO COMPtrol Goat anti-mouse (lambda)	Spherotech Inc.	CMIgP-30-5H
CompBeads Anti-Mouse Ig,k	BD Biosciences	51-90-9001229
5 ml Polystyrene tube with strainer cap	FALCON	352235
Aqua Live/Dead stain	Invitrogen/ThermoFisher	L34976	dilute 1:800
Mouse Anti-Human CD3 BV650 clone SP34-2	BD Biosciences	563916	dilute 1:40
Mouse Anti-Human CD4 BV786 clone L200	BD Biosciences	563914	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD8 BUV496 clone RPA-T8	BD Biosciences	564804	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD28 BV711 clone CD28.2	Biolegend	302948	dilute 1:20
Mouse Anti-Human CD95 BUV737 clone DX2	BD Biosciences	564710	dilute 1:10
Mouse Anti-Human CD14 BV510 clone M5E2	Biolegend	301842	dilute 1:83
Mouse Anti-Human CD16 BV510 clone 3G8	Biolegend	302048	dilute 1:167
Mouse Anti-Human CD20 BV510 clone 2H7	Biolegend	302340	dilute 1:37
Anti-CD38-R PE clone OKT10	NHP reagent recource	N/A	dilute 1:100
Mouse Anti-Human CD69 BUV395 clone FN50	BD Biosciences	564364	dilute 1:10
Mouse Anti-Human HLA-DR APC-H7 clone G46-6	BD Biosciences	561358	dilute 1:20
Mouse Anti-Human ICOS Alexa Fluor 700 clone C398.4A	Biolegend	313528	dilute 1:80
Instruments
BioPrptect Containment Enclosure	Baker
BD FACS Aria	BD Biosciences
ProtoFlex Dual 96-well PCR system	Applied Biosystems/ThermoFisher	4484076
Quant Studio 6 qPCR instrument	Applied Biosystems/ThermoFisher	4485694
IFC controller HX	Fluidigm	IFC-HX
Biomark HD	Fluidigm	BMKHD-BMKHD