Summary
علينا أن نظهر طريقة جديدة لبناء المستندة إلى خلية مفردة ثلاثي الأبعاد (3D) جمعية دون سقالة اصطناعية.
Abstract
هندسة الأنسجة والطب التجديدي توفر العديد من المزايا لعلاج الأمراض المستعصية، وقد أثبتت العديد من الدراسات أهمية ثلاثية الأبعاد (3D) جمعيات الخلوية في هذه الميادين. غالباً ما استخدمت السقالات اصطناعية بناء تجميعات الخلوية 3D. ومع ذلك، السقالات المستخدمة لبناء التجميعات الخلوية السامة في بعض الأحيان وقد تتغير خصائص الخلايا. وهكذا، سيكون مفيداً وضع طريقة غير سامة لتيسير الاتصال خلية خلية. في هذه الورقة، نقدم طريقة جديدة لبناء التجميعات الخلوية مستقرة باستخدام ملاقط بصرية مع ديكستران. ومن مزايا هذا الأسلوب أن ينشئ مستقرة خلية إلى خلية الاتصال في غضون دقائق قليلة. هذا الأسلوب الجديد يسمح بناء التجميعات الخلوية ثلاثية الأبعاد في بوليمر ماء طبيعي، ومن المتوقع أن تكون مفيدة لبناء التجميعات خلية واحدة 3D الجيل القادم في ميادين الطب التجديدي، وهندسة الأنسجة.
Introduction
بينما تتألف من عدة جمعيات من خلايا الأنسجة البشرية ويمكن أن تساعد على الحفاظ على التوازن للجسم، الخلايا المفردة بحد ذاتها أيضا أدواراً هامة عبر التفاعل خلية بخلية. ولذلك، من المهم توضيح كيف يمكن حفز الخلايا المفردة بإشارات خارجية وكيف أنها تنقل هذه الإشارات إلى الخلايا الأخرى ملتصقة. لهذا الغرض، تم إنشاء العديد من الطرق لبناء التجميعات (3D) ثلاثي الأبعاد المستندة إلى خلية مفردة1،2،3،،من45،6 ،،من78. ومع ذلك، يمكن لا يزال تحسين المواد التي يتم استخدامها لإنشاء تجميعات الخلوية. على سبيل المثال، المواد الهلامية الاصطناعية والبوليمرات بما في ذلك البولي إثيلين غليكول (شماعة) تمتلك بعض الخصائص الفيزيائية الكيميائية وقد تؤثر على الخلايا المستهدفة (علىسبيل المثال، السمية).
نحن ذكرت مؤخرا نظام رواية التي يمكن إنشاء تجميع 3D المستندة إلى خلية واحدة من الخلايا باستخدام ديكستران (DEX) بإنشاء خلية مستقرة-خلية الاتصال9. نحن نعتبر أن هذه التكنولوجيا يمكن أن تكون مفيدة في العديد من المجالات البحثية، بما في ذلك الطب التجديدي، وحتى سرطان علم الأحياء. وفي هذا التقرير، يصف لنا كيف يمكننا التعامل مع الخلايا المفردة وبناء ثلاثي الأبعاد (3D) جمعيات الخلوية حضور بيوماكروموليكوليس ماء مختلفة بما في ذلك التنفيذ المباشر دون سقالة اصطناعية.
Protocol
1-إعداد الخلايا
- الحفاظ على التحاليل الماوس الغدة الثديية الخلايا الظهارية (نمومج خلايا) مع 5 مل من د-الفنزويلية التي تحتوي على 10% (v) الجنين البقري (FBS) والمصل 1% (v) البنسلين-ستربتوميسين (P/S) في قارورة3 25 سم. إزالة دولبيكو تعديل المتوسطة النسر (د-الفنزويلية)، التي تحتوي على 10% FBS و 1% P/s.
- إضافة 3-5 مل من 37 درجة مئوية مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) (-) إلى قارورة. لاحظ أن الرقم الهيدروجيني لبرنامج تلفزيوني 7.1-7.3.
- إزالة كل برنامج تلفزيوني من قارورة استخدام المضخة.
- إضافة 1.5 مل التربسين 37 درجة مئوية (0.25%، w/v) قارورة.
- احتضان قارورة لمدة 1-2 دقيقة تقريبا عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO.
- إضافة 3.5 مل من د-الفنزويلية التي تحتوي على 10% FBS و 1% P/S إلى قارورة. ماصة المزيج.
- نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل والطرد المركزي أنه لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أن نصف قطر دوران وسرعة دوران النابذة هي 16.6 سم و 1500 دورة في الدقيقة، على التوالي. تحت هذا الشرط، قوة الطرد المركزي النسبي 417 x ز.
- إضافة 5 مل MEM د جديدة (10% FBS و 1% P/S) بقارورة بعد يسفط المتوسطة (إذا كان ذلك مطلوباً، كريوبريسيرفي الخلايا مع الحل للواسمات، اتباع إرشادات الشركة المصنعة).
2-إعداد ديكستران (DEX)
- إعداد 80 ملغ/مل من محلول التنفيذ المباشر عن طريق خلط 10 مل من د-الفنزويلية (10% FBS، 1%P/S) و 0.8 غرام من التنفيذ المباشر. لاحظ أنه يمكن تصفية الحل التنفيذ المباشر مع عامل تصفية المحاقن (0.22 ميكرومتر) بعد أن يكون مثقف الخلايا لفترة كافية.
- إعداد تعليق خلية التي تحتوي على 40 مغ/مل متوسطة التنفيذ المباشر بخلط 200 ميليلتر من حل التنفيذ المباشر و 200 ميليلتر من تعليق خلية أعدت في 2.1. ملاحظة أن كثافة عدد من الخلايا في الحل هو حوالي 2.3 × 105 خلايا/مل.
3-الإعداد لليزر والفحص المجهري
- قم بتشغيل الليزر (موجه مستمرة، الطول الموجي نانومتر 1,064) (الشكل 1). لاحظ أن استخدام شعاع الليزر بطول موجه باللون الأحمر إلى المنطقة القريبة من الأشعة تحت الحمراء الأكثر فعالية؛ تسمى هذه المنطقة الطول الموجي نافذة التشخيصية والعلاجية10 حيث أنه يمتص الحد الأدنى من الخلايا.
- انقر نقراً مزدوجاً فوق الرمز البرامج.
- انقر نقراً مزدوجاً فوق رموز الكاميرا ①، أدى ② (الصمام)، تركيز ③ ضبط، و ④ مرحلة الانتقال. يقوم بعرض المقابلة ① ④ سوف تظهر (الشكل 1ب).
4-خلية التلاعب باستخدام "نظام تعويض اللون الليزر"
- 20 مكان ميكروليتر من عينة إعدادها في الخطوة 2، 2 على زجاج الغطاء السفلي (سمك 0.17 ملم، وحجم = 30 ملم × 40 ملم)، وتغطية ذلك مع زجاج الغطاء العلوي (سمك 0.17 ملم، وحجم = 18 ملم × 18 ملم)، مع فصل المقدمة من الفواصل اثنين (0.17 ملم سمك الحجم = 10 مم × 24 مم)، كما هو موضح في الشكل 2. علما أن هذه النظارات لا تتطلب طلاء خاص.
- وضع الخلية عينة إعدادها في الخطوة 4، 1 في عدسة الهدف أقل (الماء الغمر مع ca. 10 ميكروليتر، التكبير = 60 X، المسافة العمل = 0.28 ملم، الفتحة العددية = 1.2)).
- إرفاق عدسة الهدف الأعلى (الماء الغمر مع ca. 10 ميكروليتر، التكبير = 60 X، المسافة العمل = 2 مم، الفتحة العددية = 1.0) في الجزء العلوي من الخلية عينة.
- قم بتشغيل الصمام الخفيفة بواسطة النقر فوق رمز 2 (الشكل 1ب).
- ضبط المسافة بين العينة وعدسة الهدف أقل بواسطة النقر فوق الرموز الموجودة على لوحة 3 (الشكل 1ب) حتى يكون في التركيز.
- تشعيع أشعة الليزر في موقف 1 و 2 موقف (الشكل 1ب) العينة بواسطة النقر فوق الرموز الأول، والثاني، والثالث (الشكل 1ب).
- تعيين كثافة كل شعاع الليزر إلى 1500 ميغاواط عن طريق إدخال هذه القيمة في الرمز الرابع (الشكل 1ب).
- نقل المحاصرين مرحلة النموذج بواسطة النقر فوق رمز 4 التي تشير إلى اتجاهات (الشكل 1ب) حتى خلية في الموضع 1 (الشكل 1ب).
- اسحب المؤشر يشير إلى موقف 2 (الشكل 1ب) حتى آخر خلية المحاصرين في الموضع 2.
5-تشييد هيكل الخلية (3D) ثلاثي الأبعاد
- التلاعب خلية واحدة بحيث تكون على اتصال مع خلية أخرى. المحافظة على هذا الشرط ل 300 s; أي، يتعرض كل خلية لليزر ل 300 s.
- سجل س ص المحور هو مبين في الشكل 1ب.
- إنشاء تجميع خلية ثنائية الأبعاد تعسفي بمحاصرة ونقل خلية أخرى للخلايا.
- بناء جمعية خلوية 3D قبل الانتقال المرحلة صعودا وهبوطاً.
- وتؤكد أن الجمعية العامة لا تزال مستقرة بعد إيقاف تشغيل الليزر.
Representative Results
ويبين الشكل 1 بالمجهر والبرمجيات المستخدمة في هذه الدراسة. الرقم 2 تمثيل تخطيطي للإجراء المتعلق بوضع نموذج الحل الذي يحتوي على الخلايا. يوضح الشكل 3 تشكيل هيكل هرمي استخدام الملقط الضوئية المزدوجة-شعاع. إذا نجحت هذه التجربة، هذه التجميعات الخلوية تظل مستقرة حتى بعد إيقاف تشغيل الليزر.
الشكل 1 : (أ) نظام مراقبة "نظام تعويض اللون الليزر" (NanoTracker2 (11)). يتم تنشيط النظام عن طريق تشغيل التبديل الليزر اتباع الخطوات ① ③. (ب) برنامج للسيطرة على "نظام تعويض اللون الليزر". الكاميرا، أدى ضبط تركيز الضوء، والانتقال من مرحلة يتم تنشيطها بواسطة النقر فوق الرموز ① ②، ③ و ④، على التوالي. يتم عرض الصورة المجهرية في لوحة 1. تشغيل/إيقاف تشغيل عنصر التحكم للصمام في لوحة 2. يتم التحكم التركيز في لوحة 3. أشعة الليزر هي المشع في مواقف 1 و 2 بواسطة النقر فوق الرموز الأول إلى الرابع. قدم تفاصيل هذا "سيستيماري مما أدى إلى محاصرة الليزر" في الرقم (12). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: التمثيل التخطيطي لوضع الزجاج الشريحة. 20 ميكروليتر من العينة (تعليق الخلية التي تحتوي على ديكستران) وضعها على الشريحة وتستخدم للتلاعب بالليزر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 :) تجميعات خلايا الظهارية (نمومج) الشكل المقصود في متوسط مع التنفيذ المباشر (40 مغ/مل): يرد هرم كمثال على مجموعة ثلاثية الأبعاد. ب) كما يظهر شكل تخطيطي للجمعية الخلوية 3D على شكل هرم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
هذه الدراسة يظهر تطبيق ملموس لدينا9،التقارير الأخيرة11 على استخدام البوليمرات القابلة للذوبان لبناء 3D خلية واحدة التجميعات. ستابلي تتشكل هذه الجمعيات في حل الجزء الأكبر عند العدد الخلايا تصل إلى 10، ويمكن أن يعقد بشعاع ليزر واحدة. التجميعات يعجل على سطح الزجاج عندما يكون هناك أكثر من 10 خلايا. ورغم أن التجارب لا تزال في مرحلة بدائية، ونتوقع أن المنهجية الجديدة التي يمكن أن تكون أداة قوية لبناء التجميعات خلية واحدة 3D الجيل القادم، التي لا غنى عنها للتقدم في مجالات البيولوجيا الخلية و الطب التجديدي.
في محلول يحتوي على لا البوليمر، صد الخلايا بعضها البعض بسبب التنافر الالكتروستاتيكي الناشئة عن تهمة السطحية وقوة التنافر ترطيب، أثر النفور جليكوكاليكس وتموج الغشاء. وأظهرت دراستنا السابقة أن أزواج خلية يمكن أن تكون مستقرة لفترة طويلة عندما تعامل الخلايا مع الوتد. الأهم من ذلك، تقترح النقل الناجح لزوج الخلية إلى منطقة بدون شماعة، بعد عقد الخلايا في الاتصال لمدة 5 دقائق في الوتد، المحافظة على الاتصال الخلوية بطريقة مستقرة. ويفسر هذا أيضا فيما يتعلق بتأثير استنفاد11، وأساساً نفس الآلية ينطبق على الجمعيات الخلوية التي تم إنشاؤها باستخدام التنفيذ المباشر9. لدينا النتائج الحالية تشير إلى أنه يمكن أيضا استخدام أنواع أخرى من الجزيئات الطبيعية لبناء التجميعات الخلوية 3D مستقرة.
للنقل السريع للخلايا، من المهم تركيز البوليمر. عموما، تزيد لزوجة الحل جذريا عند حل البوليمر أعلاه تركز التداخل. تحت هذه الظروف، من الصعب التعامل مع الخلايا باستخدام ملاقط بصرية. ومن ثم، ينبغي أن تجري التجربة دون تركيز التداخل. لحل التنفيذ المباشر، هو تركيز التداخل ca. 50 ملغ/مل (اللزوجة الحركية 5.5 ملم/2ق). كما هو موضح في الرقم 9، لوحظ جمعية خلوية مستقرة عند تركيز التنفيذ المباشر 10 ملغ/مل إلى 40 مغ/مل. هذه النتيجة تشير إلى أن تأثير استنفاد كبيرة بما فيه الكفاية للحفاظ على الاتصال خلية-خلية مستقرة حتى عند تركيز التنفيذ المباشر أقل من تركيز التداخل. فقد ثبت أن إضافة التنفيذ المباشر لا يؤثر على بقاء الخلية تصل إلى 40 مغ/مل 9.
إنشاء أسلوب لبناء التجميعات الخلوية ثلاثية الأبعاد الهامة في مجال الطب التجديدي، منذ يقلد في فيفو المكروية الخلوية بهيكلة الخلايا المفردة قد ييسر الأنسجة المستمدة من الخلايا الجذعية تشكيل. حتى الآن، فقد استخدمنا هذا البروتوكول لبناء التجميعات الخلوية باستخدام خلايا Neuro2A9 بالإضافة إلى خلايا نمومج. ونأمل أن وضع منهجية تجريبية لبناء التجميعات الخلوية ثلاثية الأبعاد لعدد أكبر من خلايا مورفولوجيس مختلفة. النظام ملاقط بصرية طورتها اشيكاوا et al. 13 تطبق لهذا الغرض حيث يمكن التحكم باتجاه الخلايا. وينبغي المزيد من التجارب على هذا المنوال واعدة.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون هاشيموتو شو، يوشيدا المنظمة العربية للتصنيع، واوتا تايكو في جامعة دوشيشا لمساعداتها السخية مع الإعداد التجريبية. وأيد هذا العمل كاكينهي (ح 15 02121، 15 ك 05400، 25103012، 50587441)، والبرنامج ميكستسوبورتيد عن "مؤسسة الأبحاث الاستراتيجية" في الجامعات الخاصة. هذه الدراسة أيضا تدعمها منحة بولندية من معرفته (قيادة المركز القومي للبحوث) العلمية الكونسورتيوم "الحيوان صحية – الغذاء المأمون"، قرار وزارة العلوم والتعليم العالي رقم 05-1/KNOW2/2015...
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
- Aloysious, N., Nair, P. D. Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Scientific Reports. 5, 8577 (2015).
- Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel. ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).
- Liu, Z. Q., et al. Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation. Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).
- McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells. World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
- Sadovska, L., et al. A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).
- Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).
- Yoshida, A., et al. Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold. Polymers. 9, 319 (2017).
- Anderson, R. R., Parrish, J. A. Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation. Science. 220, 524-527 (1983).
- Hashimoto, S., et al. Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer. Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).
- Rauch, P., Jähnke, T. Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments. Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).
- Ichikawa, M., et al. Tilt control in optical tweezers. Journal of Biomedical Optics. 13, 010503 (2008).
