Biochemistry

מניפולציה מתאים חיים לבנות יציב הרכבה הסלולר 3D ללא לגרדום מלאכותי

Published: October 26, 2018 doi: 10.3791/57815

Takehiro Yamazaki*¹, Hiroaki Taniguchi*², Shoto Tsuji¹, Shiho Sato¹, Takahiro Kenmotsu¹, Kenichi Yoshikawa¹, Koichiro Sadakane¹

¹Faculty of Life and Medical Sciences, Doshisha University, ²The Institute of Genetics and Animal Breeding, Polish Academy of Sciences

* These authors contributed equally

Summary

נדגים שיטה לבניית אסיפה מבוססת על תא בודד (3D) תלת-ממדי ללא לגרדום מלאכותי.

Abstract

רפואה רגנרטיבית ו הנדסת רקמות מציעים מספר יתרונות לטיפול של מחלות עיקשות, מספר מחקרים הראו את החשיבות של תלת-ממדי (3D) הרכבות הסלולר בתחומים אלה. פיגומים מלאכותי שימשו לעיתים קרובות כדי לבנות הרכבות סלולרית תלת-ממד. אולם, פיגומים נהגו לבנות הרכבות הסלולר לפעמים רעילים, עשויים לשנות את המאפיינים של התאים. לכן, זה יהיה מועיל להקים שיטה רעיל להקלה על קשר תא-תא. במאמר זה, נסקור שיטה לבניית הרכבות הסלולר יציבה באמצעות מלקחיים אופטיים עם לתוספי. אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי היא מקימה קשר יציב-לתא בתוך דקות ספורות. שיטה חדשה מאפשרת הבנייה של הרכבות הסלולר 3D פולימר הידרופילית טבעי, צפוי להיות שימושי עבור בניית הדור הבא הרכבות תא בודד 3D בתחומים של רפואה רגנרטיבית, הנדסת רקמות.

Introduction

בעוד ברקמות אנושיות מורכבים מספר מכלולים של תאים שיכולים לסייע לך לשמור על הומאוסטזיס של הגוף, תאים בודדים בכוחות עצמם גם לשחק תפקידים חשובים באמצעות אינטראקציה לתא. לכן, חשוב להבהיר כיצד תאים בודדים יכול להיות מגורה על ידי אותות חיצוניים וכיצד הם להעביר אותות כאלה אחרים תאים חסיד. למטרה זו, הוקמו מספר שיטות להקמת מבוססת על תא בודד את תלת-ממדי הרכבות (3D)¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶⁷^, ^,⁸. עם זאת, החומרים בהם נעשה שימוש כדי לבנות הרכבות הסלולר עדיין ניתן לשפר. לדוגמה, ג'לים סינתטי, פולימרים כולל פוליאתילן גליקול (PEG) בעלי מאפיינים physicochemical כימיים מסוימים, עלולה להשפיע על התאים היעד (למשל, רעילות).

לאחרונה דיווחנו מערכת הרומן שיכול ליצור אסיפה 3D מבוססת על תא בודד של תאים באמצעות לתוספי (דקס) על-ידי יצירת קשר יציב תא תא⁹. אנחנו נחשבים כי טכנולוגיה זו יכול להיות שימושי במספר שדות מחקר, כולל רפואה רגנרטיבית ו אפילו וביולוגיה של סרטן. בדו ח זה, אנו מתארים איך לתפעל תאים בודדים ולבנות תלת-ממדי (3D) הרכבות הסלולר בנוכחות שונים הידרופילית ובמקרו-מולקולות ביולוגיות לרבות דקס לגרדום מלאכותי.

Protocol

1. הכנת תאים

לשמור על NAMRU (תאי NMuMG) בתאי אפיתל עטין עכבר עם 5 מ של D-מ המכיל 10% (v) העובר שור סרום (FBS) ו- 1% (v) פניצילין-סטרפטומיצין (P/S) בבקבוקון³ 25 ס מ. של הסרה Dulbecco שונה בינונית של הנשר (D-מ), המכיל 10% FBS ו 1% P/S.
להוסיף 3-5 מ ל תמיסת 37 ° C באגירה פוספט (PBS) (-) הבקבוקון. שימו לב כי ה-pH של PBS 7.1-7.3.
הסר כל טוב, מגניב. הבקבוק באמצעות של העצמות.
להוסיף 1.5 מ של 37 ° C טריפסין (0.25%, w/v) הבקבוקון.
תקופת דגירה את הבקבוקון של 1-2 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס חממה₂ CO.
להוסיף מ 3.5 ל D-מ המכיל 10% FBS ו 1% P/S הבקבוקון. פיפטה לערבב.
להעביר את המתלים תא שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל, centrifuge זה למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. שימו לב כי רדיוס הסיבוב ומהירות הסיבוב לצנטריפוגה ס"מ 16.6 ו 1500 סל ד, בהתאמה. תחת תנאי זה, הדיסקה היחסי הוא 417 x g.
הוסף 5 מ ל D טריים-מ (10% FBS ו 1% P/S) הבקבוקון לאחר כ רפה בעברית המדיום (אם יש צורך, cryopreserve תאי הקפאה קריוגנית פתרון, בעקבות הוראות היצרן).

2. הכנת לתוספי (דקס)

הכן 80 מ"ג/מ"ל של דקס פתרון על ידי ערבוב 10 מ"ל של D-מ (10% FBS, 1%P/S) ו- 0.8 גר' דקס. שימו לב כי ניתן לסנן את הפתרון דקס עם מסנן מזרק (0.22 מיקרומטר) לאחר התאים יש תרבותי למשך זמן מספיק.
להכין השעיה התא המכיל 40 מ"ג/מ"ל דקס בינוני על ידי ערבוב µL 200 בפתרון דקס, 200 µL של התליה תא המבושלות 2.1. שימו לב כי צפיפות מספר של תאים בהפתרון הינו כ 2.3 × 10⁵ תאים למ"ל.

3. הכנה לייזר ומיקרוסקופיה

להפעיל את הלייזר (גל רציף, 1,064 באורך גל של nm) (איור 1). שימו לב כי השימוש של קרן לייזר עם אורך גל אדום-סגול אזור הינו היעיל ביותר; אזור באורך גל זה נקרא חלון האבחון והטיפול¹⁰ מאז זה נספג מינימלית על ידי התאים.
לחץ פעמיים על סמל התוכנה.
לחץ פעמיים על שהסמלים עבור המצלמה ①, ② דיודות פולטות אור (LED), מיקוד ③ להתאים ולאחר ④ עובר שלב. מציג המתאים ①-④ יופיע (איור 1b).

4. תא מניפולציה באמצעות מערכת לייזר השמנה

מקום 20 µL של המדגם מוכן בשלב 2.2 על הזכוכית המכסה התחתון (0.17 מ מ עובי, גודל = 30 מ"מ × 40 מ"מ), ומכסים אותו עם הזכוכית המכסה העליון (0.17 מ מ עובי, גודל = 18 מ מ × 18 מ מ), עם הפרדה שסופקו על-ידי שני מפרידי (0.17 מ מ עובי גודל = 10 מ"מ × 24 מ"מ), כמוצג באיור2. שימו לב כי המשקפיים האלה אינם מחייבים ציפוי מיוחד.
במקום התא מדגם מוכן בשלב 4.1 העדשה המטרה נמוכה (מים טבילה עם ca. 10 μl, הגדלה = 60 X, ומרחק עבודה = 0.28 מ מ, מפתח נומרי = 1.2)).
לצרף את העדשה המטרה העליונה (מים טבילה עם ca. 10 μl, הגדלה = 60 X, ומרחק עבודה = 2 מ מ, מפתח נומרי = 1.0) בחלק העליון של התא הדגימה.
הפעל את ה-LED אור על-ידי לחיצה על הסמל 2 (איור 1b).
להתאים את המרחק בין המדגם העדשה המטרה נמוכה יותר על-ידי לחיצה על הסמלים בלוח 3 (איור 1b) עד שיהיה בפוקוס.
להאיר את קרני לייזר עמדה 1 ו- 2 עמדה (איור 1B) של המדגם על ידי לחיצה על סמלים אני II, III (איור 1b).
להגדיר את עוצמת הלייזר כל 1,500 מגה-וואט על-ידי הזנת ערך זה על הסמל הרביעי (איור 1b).
. מהלך הבמה לדוגמה על-ידי לחיצה על סמל 4 כיוונים אנלוגיים (איור 1b) עד תא נלכד-עמדה 1 (איור 1b).
גרור הסמן המציין מיקום 2 (איור 1b) עד תא אחר הוא לכוד-מיקום 2.

5. בניית מבנה תלת-ממדי (3D) תא

לטפל תא יחיד כך שיהיה בקשר עם תא אחר. לשמור על מצב זה 300 s; קרי, כל תא הוא נחשף לייזר עבור 300 s.
להקליט את ציר X-Y שמוצג באיור 1ב'.
לבנות הרכבה תא 2D שרירותי על-ידי לכידה והעברה תא אחר לתאים.
לבנות אסיפה סלולרית תלת-ממד על-ידי הזזת השלב למעלה ולמטה.
לאשר כי מכלול נשאר יציב, אחרי הלייזר כבוי.

Representative Results

איור 1 מציג את המיקרוסקופ והתוכנה השתמשו במחקר זה. איור 2 היא ייצוג סכמטי של ההליך עבור הצבת הפתרון מדגם המכיל תאים. איור 3 מדגים היווצרות של מבנה פירמידה באמצעות מלקחיים אופטיים כפול-קרן. אם הניסוי יצליח, מהרכבות הסלולר אלה נשארים בעינם גם לאחר הלייזר כבוי.

איור 1 : (א) מערכת הבקרה עבור מערכת לייזר השמנה (NanoTracker2 (11)). המערכת מופעלת על-ידי הפעלת המתג לייזר ביצוע השלבים ①-③. (b) התוכנה לשליטה במערכת השמנה לייזר. המצלמה, הוביל אור, מיקוד להתאים ולאחר הזזת הבמה מופעלים על ידי לחיצה על סמלים ①, ②, ③ ו ④, בהתאמה. התמונה המיקרוסקופית מוצגת בלוח 1. הפקד/ביטול עבור ה-LED הוא בלוח 2. המוקד נשלטת בלוח 3. קרני לייזר הן מוקרן על עמדות 1 ו- 2 על ידי לחיצה על סמלים את הרביעי. הפרטים של Systemare השמנה זה לייזר מסופקים הפניה למעורר (12). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: נציג מפרטים טכניים עבור הצבת הזכוכית שקופיות. µL 20 המדגם (השעיה התא המכיל לתוספי) הוא הניח בשקופית ולא להשתמש בו עבור לייזר מניפולציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 :) מכלולים של תאי אפיתל (NMuMG) של צורת המיועדים ב מדיום עם דקס (40 מ"ג/מ"ל): פירמידה מוצג בתור דוגמה של אשכול תלת-ממד. b) איור סכמטי בצורת פירמידה תלת-ממדי הסלולר ההרכבה מוצג גם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

המחקר הנוכחי מראה יישום בטון שלנו⁹^,האחרונות דוחות¹¹ על השימוש של פולימרים מסיסים לבנייה של הרכבות בתא יחיד תלת-ממד. הרכבות כזה stably נוצרים הפתרון בכמות גדולה כאשר הוא עד 10 מספר התאים, יכולים להיות מוחזקים על ידי קרן לייזר בודד. הרכבות לזרז על משטח זכוכית, כאשר ישנם יותר מ- 10 תאים. למרות הניסויים הם עדיין בשלב הפרימיטיבי, אנו מצפים כי המתודולוגיה רומן יכול להיות כלי רב עוצמה עבור הבנייה של מכלולים תא בודד 3D הדור הבא, אשר הכרחית להתקדמות בתחומים של ביולוגיה של התא, רפואה רגנרטיבית.

בפתרון המכיל פולימר לא, תאים להדוף את אחד את השני בשל אלקטרוסטטית חדירה והדיפ ה הנובעים משטח הטעינה, הכוח סלידה הידרציה, אפקט דחיה glycocalyx ו גליות ממברנה. שלנו מחקר קודם הראה כי זוגות התא יכול להיות יציבה במשך זמן רב כאשר התאים מטופלים עם פג. וחשוב מכך, התעבורה מוצלחת של זוג תא לאזור ללא פג, לאחר התאים הוחזקו במתקן קשר למשך 5 דקות בפג, עולה כי נשמר קשר סלולרי בצורה יציבה. זה טוב מוסבר במונחים של השפעה דלדול¹¹, ומחילה בעצם באותו המנגנון ההרכבות הסלולר שנוצר באמצעות דקס⁹. התוצאות הנוכחיות שלנו מראים כי סוגים אחרים של מקרומולקולות טבעי גם יכול לשמש כדי לבנות יציב הרכבות סלולרית תלת-ממד.

למשלוח מהיר של תאים, חשוב הריכוז של פולימר. באופן כללי, צמיגות של הפתרון מגדילה באופן דרסטי הפולימר הוא נמס מעל הריכוז חפיפה. בתנאים האלה, קשה לתמרן תאים באמצעות מלקחיים אופטיים. לפיכך, הניסוי צריכה להתבצע מתחת הריכוז חפיפה. פתרון דקס, ריכוז חפיפה היא ca. 50 מ"ג/מ"ל (צמיגות קינטי הוא 5.5 מ מ²/s). כפי שמוצג הפניה למעורר 9, אסיפה הסלולר יציב נצפתה כאשר הריכוז של דקס היה 10 מ"ג/מ"ל עד 40 מ"ג/מ"ל. תוצאה זו עולה כי השפעת המחסור הוא גדול מספיק לשמור על קשר יציב תאים תאים גם כאשר הריכוז דקס הוא נמוך יותר מאשר הריכוז חפיפה. הוכח, כי התוספת של דקס אינה משפיעה על יכולת הקיום של התא עד 40 מ"ג/מ"ל ⁹.

הקמת שיטה לבנייה של הרכבות סלולרית תלת-ממד חשוב בתחום של רפואה רגנרטיבית, מאז מחקה של ויוו microenvironment תאית על ידי מבנה תאים בודדים יכולים להקל רקמת תאי גזע-derived צורה. עד כה השתמשנו בפרוטוקול הנוכחי כדי לבנות הרכבות הסלולר באמצעות תאים Neuro2A⁹ בנוסף NMuMG תאים. אנו מקווים ליצור מתודולוגיה ניסיוני עבור בניית 3D הסלולר מכלולים של מספר גדול יותר של תאים של מורפולוגיות שונות. מלקחיים אופטיים המערכת שפותחה על ידי. Ichikawa et al. ¹³ יהיה רלוונטי למטרה זו מאז הכיוון של התאים ניתנים לשליטה. ניסויים נוספים לאורך שורות אלה צריך להיות מבטיח.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים תודה שו השימוטו, Aoi יושידה, של והטה טאאקו באוניברסיטת Doshisha על תרומתם הנדיבה עם הגדרת ניסיוני. עבודה זו נתמכה על ידי KAKENHI (15H. 02121, 15 05400 K, 25103012, 50587441) על ידי התוכנית MEXT-Supported עבור קרן מחקר אסטרטגי באוניברסיטאות הפרטי. מחקר זה גם נתמך על ידי מענק הפולני של קונסורציום מדעי ידע (מוביל מרכז המחקר הלאומי) "חיה – בטוח אוכל בריא", החלטה של משרד המדע, השכלה גבוהה מס 05-1/KNOW2/2015.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope IX71	Olympus	IX71
Dextran(200,000; molecular biology-grade)	Wako	CAS.NO 9004-54-0
Laser Trapping System (NanoTracker 2)	JPK Instruments	S/N T-05-0200
Upper Objective Lens	Olympus	LUMPLFLN60XW
Lower Objective Lens	Olympus	UPLSAPO60XW
Top Cover Glass	MATUNAMI	C022401
Intermediate Cover Glass (Spacer)	MATUNAMI	-	custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm)
Bottom Cover Glass	MATUNAMI	C030401
Camera	The Imaging Source	DFK 31AF03
Software	JPK Instruments	NanoTracker2 PFM software
NMuMG cells	RIKEN BRC	RCB2868
PBS	Wako	166-23555
Cell banker	Nippon Zenyaku Kogyo	ZR621
D-MEM	Wako Pure Chem. Ind., Japan	044-29765
FBS	Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan	172012-500ML
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200056
Penicillin-Streptomycin	Wako Pure Chem. Ind., Japan	161-23181