Summary
人工足場なしシングル ・ セル ・ ベースの 3 次元 (3 D) アセンブリを構築するための手法を示す.
Abstract
再生医療・組織工学を提供する難治性疾患の治療のためのいくつかの利点と、いくつかの研究は、これらのフィールドで 3 次元 (3 D) 携帯電話アセンブリの重要性を実証しています。人工足場は、携帯電話の 3 D アセンブリを構築するためしばしば使用されています。しかし、携帯電話アセンブリの構築に使用される足場が有毒なことがあります、セルのプロパティを変更することがあります。したがって、細胞間の接触を促進するための非毒性手法の確立に有益ででしょう。デキストランと光ピンセットを使用して安定した細胞アセンブリを構築する手法を紹介します。この方法の利点の 1 つは、数分以内安定した細胞間接触を確立することです。この新しいメソッドは天然の親水性高分子の 3 D 携帯電話アセンブリの建設を可能し、される再生医療や組織工学の分野における次世代 3 D シングル セル ・ アセンブリの構築に役立てる予定です。
Introduction
ヒト組織細胞の複数のアセンブリで構成されています、体の恒常性を維持するために助けることができる、自分自身による単一細胞も再生重要な役割細胞間相互作用を介して。したがって、外部信号による単一細胞を刺激できる方法と彼らは他の付着性のセルにこのような信号を転送方法を解明することが重要です。この目的のためいくつかの方法は、単一細胞に基づく 3 次元 (3 D) アセンブリ1,2,3,4,5,6 の建設のため確立されています。 ,7,8。ただし、携帯電話アセンブリの構築に使用される材料は改善できます。たとえば、合成ゲルおよび高分子のポリエチレング リコール (PEG) を含む特定の化学物質の物理化学的性質を持っているし、標的細胞 (例えば毒性) に影響を与える可能性があります。
我々 は最近安定した細胞接触9を確立することによってデキストラン (DEX) を用いた細胞の単一細胞ベースの 3 D アセンブリを生成することが新しいシステムを報告しました。我々 は、この技術が再生医療とも癌生物学などを含むいくつかの分野で役に立つかもしれないことと見なされます。本報告では、単一セルを操作方法と人工足場なし DEX を含む様々 な親水性生体高分子の存在下での 3 次元 (3 D) 携帯電話アセンブリを構築について説明します。
Protocol
1. 細胞の調製
- D MEM 含む 10% (v) ウシ胎児血清 (FBS) の 1% (v) ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S) 25 cm3フラスコ 5 mL と NAMRU マウス乳腺上皮細胞 (NMuMG 細胞) を維持します。削除ダルベッコ修飾イーグル培地 (D-MEM)、10 %fbs および 1% を含む P/s.
- 37 ° C リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (-) 3-5 mL をフラスコに追加します。PBS の pH が 7.1 7.3 であることに注意してください。
- アスピレーターを使用してフラスコからすべての PBS を削除します。
- 37 ° C トリプシン 0.25% (w/v) 1.5 mL をフラスコに追加します。
- フラスコ CO2インキュベーターで 37 ° C で約 1-2 分間インキュベートします。
- 追加 10 %fbs および 1% を含む D MEM の 3.5 mL フラスコに P/S。ピペットをミックスします。
- 15 mL 遠心チューブに細胞懸濁液を転送し、室温で 3 分間遠心します。回転半径と遠心分離機の回転速度は、16.6 cm 1500 rpm、それぞれに注意してください。この条件の下で相対的なの遠心力は 417 x g です。
- 新鮮な D MEM の 5 mL を追加 (10 %fbs と 1 %p/S) 培地を吸引後フラスコに (必要な場合、凍結細胞凍結保存ソリューションで、製造元の指示に従って)。
2. デキストラン (DEX) の準備
- D MEM の 10 mL を混合することによって DEX 液 80 mg/mL を準備 (10 %fbs、1%P/S) と DEX の 0.8 グラム。シリンジ フィルター (0.22 μ m) でフィルター処理することができますは DEX ソリューション、細胞が十分な時間培養した後。
- DEX 溶液 200 μ L と 2.1 で作製した細胞懸濁液 200 μ L を混合することによって 40 mg/mL DEX 媒体を含んでいる細胞懸濁液を準備します。ソリューション内のセルの数密度は約 2.3 × 105セル/mL。
3. レーザー、顕微鏡のための準備
- (連続波、1,064 nm) のレーザーを入れます (図 1、)。赤色近赤外領域からの波長を持つレーザー光の使用が最も効果的なことに注意してください。この領域の波長は、それは最低限細胞に吸収されるので診断と治療ウィンドウ10と呼ばれます。
- ソフトウェア アイコンをダブルクリックします。
- (1) カメラ、(2) 発光ダイオード (LED)、(3) フォーカス アイコンを調整をダブルクリック、(4) ステージを移動します。(1)-(4) に対応するが表示されますが表示されます (図 1b)。
4 レーザー トラップ システムを使用して細胞操作
- 手順 2.2 下のカバーガラス上で調製した試料の場所 20 μ L (厚さ 0.17 mm、サイズ = 30 mm × 40 mm)、トップ カバー ガラスでカバー (厚さ 0.17 mm、サイズ = 18 mm × 18 mm)、2 つのスペーサー (厚さ 0.17 mm によって提供される分離、サイズ = 10 mm × 24 mm)、図 2に示すように。これらのガラスに特殊なコーティングが必要としないことに注意してください。
- 手順 4.1 低い対物レンズで作製したサンプルにセルを配置 (ca. 10 μ l、倍率と浸漬を水 60 X、作動距離を = = 0.28 mm、開口数 = 1.2))。
- 上部の対物レンズを添付 (ca. 10 μ l、倍率と浸漬を水 = 60 X、作動距離 2 mm、開口を = = 1.0) サンプル セルの上部に。
- LED ライトを点灯アイコン 2 (図 1b) をクリックします。
- パネル 3 (図 1b) のアイコンをクリックして、サンプルと低い対物レンズ間の距離を調整するまで、それが焦点に。
- I、II、および III (図 1b) アイコンをクリックして、位置 1 と位置 2 (図 1B) サンプルのレーザー光を照射します。
- 各レーザー ビームの強度を 1,500 に設定アイコン IV (図 1b) にこの値を入力して mW。
- セルまで 4 のアイコンを示す方向 (図 1b) をクリックしてサンプル ステージは位置 1 (図 1b) に閉じ込められて移動します。
- ドラッグして、別のセルまでの位置 2 (図 1b) を示すカーソルが 2 位に閉じ込められました。
5、3 次元 (3 D) セル構造の建設
- 単一のセルを操作して別のセルに接触しています。300 のこの状態を維持 s;すなわち、各セルが 300 のためのレーザーにさらされている s。
- 図 1bに示すように X と Y 軸を記録します。
- トラップし、セルに別のセルを輸送して任意の 2 D セル アセンブリを構築します。
- ステージを上下に移動することによって、3 D 携帯電話アセンブリを構築します。
- レーザーはオフ後アセンブリが安定していることを確認します。
Representative Results
図 1は、顕微鏡と本研究で使用されるソフトウェアを示します。図 2細胞を含むサンプル ソリューションを配置するための手順の概略であります。ダブルビーム光学ピンセットを使用してピラミッド構造の形成を図 3に示します。実験が成功した場合、レーザーがオフにした後でも、これらの細胞アセンブリは安定しています。
図 1: (a)レーザー トラップ システムの制御システム (NanoTracker2 (11))。システムは、手順 (1) (3) レーザーのスイッチをオンにしてアクティブになります。(b)レーザー トラッピング システムを制御するためのソフトウェア。カメラ、ライト、フォーカス調整、LED し、アイコン (1)、(2)、(3)、(4) をそれぞれクリックしてアクティブ化ステージを移動します。パネル 1 で顕微鏡画像が表示されます。LED のオン/オフ コントロールはパネル 2 です。フォーカスは、パネル 3 で制御されます。アイコンをクリックすると、位置 1 と 2 で照射レーザー IV に。このレーザー トラッピング システムの詳細は、参考文献 (12) で提供。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 代表的な回路図のスライド ガラスを配置すること。20 μ L のサンプル (細胞懸濁液デキストランを含む) は、スライド上に配置、レーザー操作に使用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:) DEX (40 mg/mL) と媒体で意図されていた形の上皮細胞 (NMuMG) のアセンブリ: ピラミッドは 3 D クラスターの例として表示されます。b)ピラミッド型の 3 D 携帯電話アセンブリの模式図を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
本研究は、単一セルの 3 D アセンブリの建設のための水溶性ポリマーの使用で私たちの最近のレポートの9,11の具体的なアプリケーションを示しています。このようなアセンブリは安定して一括ソリューションで形成される細胞の数が最大 10、単一のレーザービームが保持できるとき。以上 10 個のセルがある場合、アセンブリはガラス表面に沈殿させます。実験がまだ原始的な段階で、我々 は新しい方法論が細胞生物学の分野での発展に欠かせない次世代 3 D 単一細胞アセンブリの構築のための強力なツールをかもしれない期待と再生医療。
ポリマーを含まない溶液、細胞は表面電荷、水和の反発力、糖衣反発効果及び膜から生じる静電斥力による互いを撃退します。私たちの以前の研究は、細胞を PEG で処理とき長い時間のセルのペアを安定にすることができますを示した。もっと重要なは、ペグ、セルは、固定で 5 分間接触で開催されていた後なし領域にセルのペアの成功したトランスポートは、細胞接触が安定的に維持されることを示唆しています。これも枯渇効果11面で説明しています、本質的に同じメカニズムが DEX9を使用して生成された細胞のアセンブリに適用されます。私たちの現在の結果は、天然高分子の他の種類は、安定した 3 D 携帯電話アセンブリを構築するもされる可能性があることをお勧めします。
細胞の迅速輸送、高分子の濃度が重要です。一般的には、溶液の粘性は、ポリマーが重なり濃度上解散されたときを劇的に高めます。この条件下では、光ピンセットを用いた細胞を操作することは困難です。したがって、重複濃度以下実験を行わなければなりません。DEX ソリューション重なり濃度は約 50 mg/mL (動粘度が 5.5 mm2/s)。Ref. 9 のように、安定した細胞アセンブリは DEX の濃度が 10 mg/mL 40 mg/mL に観察されました。枯渇効果が DEX 濃度が重なり濃度より低い場合でも安定した細胞接触を維持するために十分に大きいことが示唆されました。それは、DEX 添加が 40 mg/mL 9までセル実行可能性に影響を与えないことが示されています。
再生医療の分野で 3 D 携帯電話アセンブリの構築のための手法の確立が重要な生体内の模倣から単一細胞の構造細胞における微小環境を促進するかもしれない組織の幹細胞由来形成します。これまでのところ、NMuMG 細胞に加えて Neuro2A セル9を使用して細胞のアセンブリを構築する議定書を使いました。様々 な形態の細胞のより多くの 3 D 携帯電話アセンブリを構築するための実験的方法論を確立してまいります。市川らによって開発された光学ピンセット システム13はこの目的のため適用されるセルの向きを制御することができますので。これらの線に沿ってさらに試験は有望なする必要があります。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は実験のセットアップを彼らの寛大な支援ありがとう集橋本、葵吉田妙子同志社大学の太田。この仕事は、費 (15 H 02121、15 K 05400、25103012、50587441)、MEXT-Supported プログラムを私立大学戦略的研究基盤のサポートされていました。本研究は、知っている (主要な国立研究センター) の科学コンソーシアム」健康な動物 -「食の安全、科学高等教育第 05-1/KNOW2/2015 省の決定からポーランドの助成金に支えられ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
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