Summary
Demostrar un método novedoso para la construcción de un conjunto de (3D) 3 dimensiones basadas en celdas individuales sin un andamio artificial.
Abstract
Medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos ofrecen varias ventajas para el tratamiento de enfermedades intratables, y varios estudios han demostrado la importancia de asambleas celulares de 3 dimensiones (3D) en estos campos. Andamios artificiales se han utilizado a menudo para construir ensamblajes celulares 3D. Sin embargo, los andamios utilizados para construir conjuntos de celulares a veces son tóxicos y pueden cambiar las propiedades de las células. Por lo tanto, sería beneficioso establecer un método no tóxico para facilitar el contacto de la célula. En este trabajo presentamos un método novedoso para la construcción de asambleas celulares estables mediante el uso de pinzas ópticas con dextrano. Una de las ventajas de este método es el que establece contacto de célula a célula estable en pocos minutos. Este nuevo método permite la construcción de asambleas celulares 3D en un polímero hidrofílico natural y se espera que sea útil para construir la próxima generación 3D unicelular conjuntos en los campos de la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos.
Introduction
Mientras que los tejidos humanos se componen de varias asambleas de células y pueden ayudar a mantener la homeostasis del cuerpo, las células por sí mismos también desempeñan papeles importantes a través de la interacción célula a célula. Por lo tanto, es importante aclarar cómo las células pueden ser estimuladas por señales externas y cómo transfieren dichas señales a otras células adherentes. Para ello, se han establecido varios métodos para la construcción de solo celular basado en 3 dimensiones (3D) Asambleas1,2,3,4,5,6 ,7,8. Sin embargo, todavía se pueden mejorar los materiales que se utilizan para la construcción de asambleas celulares. Por ejemplo, geles sintéticos y polímeros como polietileno glicol (PEG) poseen ciertas propiedades físico-químicas químicos y pueden afectar a las células diana (p. ej., toxicidad).
Nos informó recientemente un novedoso sistema que podría generar un montaje 3D basado en célula única de células utilizando dextrano (DEX) estableciendo contacto célula-célula estable9. Consideramos que esta tecnología podría ser útil en varios campos de investigación, incluyendo la medicina regenerativa y Biología del cáncer incluso. En este informe, describimos cómo manipular las células y construir conjuntos celulares de 3 dimensiones (3D) en presencia de varios hidrofílicos biomacromoléculas incluyendo DEX sin un andamio artificial.
Protocol
1. preparación de las células
- Mantener NAMRU ratón glándula mamaria epiteliales células (NMuMG) con 5 mL de D-MEM con 10% (v) suero bovino fetal (FBS) y 1% (v) penicilina-estreptomicina (P/S) en un matraz de 25 cm3 . Quitar Dulbecco modificado medio del águila (D-MEM), que contiene 10% FBS y 1% P/S.
- Añadir 3-5 mL de solución salina de 37 ° C con tampón fosfato (PBS) (-) en el matraz. Tenga en cuenta que el pH de PBS es 7.1-7.3.
- Retirar el PBS del frasco utilizando un aspirador.
- Añadir 1,5 mL de tripsina de 37 ° C (0,25%, w/v) en el matraz.
- Incube el frasco de aproximadamente 1 a 2 minutos a 37 ° C en un incubador de CO2 .
- Añadir 3,5 mL de D-MEM con 10% FBS y 1% P/S al matraz. Pipeta para mezclar.
- Transferir la suspensión de células a un tubo de centrífuga de 15 mL y centrifugar durante 3 minutos a temperatura ambiente. Tenga en cuenta que el radio de giro y velocidad de rotación de la centrífuga son 16,6 cm y 1500 rpm, respectivamente. Bajo esta condición, la fuerza centrífuga relativa es 417 x g.
- Añadir 5 mL de D-MEM fresco (10% FBS y 1% P/S) en el matraz después de aspirar el medio (si es necesario, criopreservar las células con solución de criopreservación, siguiendo las instrucciones del fabricante).
2. preparación de dextrano (DEX)
- Preparar 80 mg/mL de solución DEX mezclando 10 mL de D-MEM (10% FBS, 1%P/S) y 0,8 g de DEX. Tenga en cuenta que la solución DEX se puede filtrar con un filtro de jeringa (0,22 μm) después de que las células han cultivado durante tiempo suficiente.
- Preparar una suspensión que contiene medio DEX 40 mg/mL mediante la mezcla de 200 μL de solución DEX y 200 μL de la suspensión preparada en el punto 2.1. Tenga en cuenta que la densidad del número de células en la solución es aproximadamente 2.3 × 105 células/mL.
3. preparación para el láser y la microscopía
- Encienda el láser (onda continua, longitud de onda de 1.064 nm) (figura 1a). Tenga en cuenta que el uso de un rayo láser con una longitud de onda en el rojo para la región del infrarrojo cercano es más eficaz; esta región de longitud de onda se llama la ventana diagnóstica y terapéutica10 ya que es mínimamente absorbida por las células.
- Haga doble clic en el icono del software.
- Haga doble clic en que los iconos de la cámara ①, ② de diódos de luz (LED), foco ③ ajustan y ④ etapa en movimiento. Se mostrará la pantalla correspondiente a ①-④ (figura 1b).
4. célula manipulación usando el sistema de captura de láser
- Lugar 20 μl de la muestra preparada en el paso 2.2 en el vidrio de la cubierta inferior (0,17 mm de espesor, tamaño = 30 x 40 mm) y cúbrala con el vidrio de cubierta superior (0,17 mm de espesor, tamaño = 18 x 18 mm), con separación de dos espaciadores (0,17 mm de espesor tamaño = 10 mm × 24 mm), como se muestra en la figura 2. Tenga en cuenta que estas gafas no requieren una capa especial.
- Colocar la celda de muestra preparada en el paso 4.1 en el objetivo inferior (inmersión con aprox. 10 μl, ampliación de agua = 60 X, distancia de trabajo = 0,28 mm, abertura numérica = 1.2)).
- Fijar el objetivo superior (inmersión con aprox. 10 μl, ampliación de agua = 60 X, distancia de trabajo = 2 mm, abertura numérica = 1.0) en la parte superior de la celda de muestra.
- Enciende el LED luz haciendo clic en el icono 2 (figura 1b).
- Ajustar la distancia entre la muestra y el objetivo inferior haciendo clic en los iconos en el panel 3 (figura 1b) hasta que esté en foco.
- Irradiar los rayos láser en posición 1 y posición 2 (figura 1B) de la muestra haciendo clic en los iconos I, II y III (figura 1b).
- Ajustar la intensidad de cada rayo láser a 1.500 mW introduciendo este valor en icono IV (figura 1b).
- Paso la etapa de muestra haciendo clic en las direcciones que indica icono 4 (figura 1b) hasta una célula está atrapada en la posición 1 (figura 1b).
- Arrastre el cursor que indica posición 2 (figura 1b) hasta otra célula está atrapado en la posición 2.
5. construcción de una estructura de 3 dimensiones (3D) celular
- Manipular una sola celda que está en contacto con otra célula. Mantener esta condición por 300 s; es decir, cada célula está expuesto a un láser de 300 s.
- Registrar el eje X que se muestra en la figura 1b.
- Captura y transporte de otra célula a las células para construir un conjunto celular 2D arbitraria.
- Construir un conjunto celular 3D moviendo arriba y abajo del escenario.
- Confirma que la Asamblea sigue siendo estable después de desconecta el láser.
Representative Results
La figura 1 muestra el microscopio y el software utilizado en este estudio. Figura 2 es una representación esquemática del procedimiento para la colocación de la solución muestra que contiene las células. Figura 3 se muestra la formación de una estructura de pirámide usando pinzas ópticas de doble haz. Si el experimento tiene éxito, estas asambleas celulares permanecen estables incluso después de desconecta el láser.
Figura 1 : (a) el sistema de control para el sistema de captura de Laser (NanoTracker2 (11)). El sistema se activa al encender el interruptor del láser siguiendo los pasos ①-③. (b) el software para controlar el sistema de captura de láser. La cámara, ajuste de luz, foco, y etapa en movimiento se activan haciendo clic en los iconos ①, ②, ③ y ④, respectivamente. La imagen microscópica se muestra en el panel 1. El control de encendido de lo LED es en el panel 2. El enfoque se controla en el panel 3. Los rayos láser son irradiados en posiciones 1 y 2 haciendo clic en los iconos I a IV. Los detalles de este Systemare de captura de láser proporcionan en Ref (12). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: esquema representativo para colocar el vidrio de la diapositiva. 20 μl de la muestra (suspensión de la célula que contiene dextrán) se coloca en la diapositiva y utilizado para la manipulación de láser. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : un) asambleas de células epiteliales (NMuMG) de forma prevista en un medio con DEX (40 mg/mL): una pirámide se muestra como un ejemplo de un clúster de 3D. b) también se muestra una Figura esquemática de la Asamblea celular 3D en forma de pirámide. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El presente estudio muestra una aplicación concreta de nuestros últimos informes9,11 sobre el uso de polímeros solubles para la construcción de ensamblajes 3D unicelular. Tales asambleas se forman estable en la solución a granel cuando el número de células es hasta 10 y puede ser sostenido por un haz de láser. Asambleas de precipitan en la superficie de vidrio cuando hay más de 10 células. Aunque los experimentos están todavía en una etapa primitiva, esperamos que la nueva metodología podría ser una poderosa herramienta para la construcción de la nueva generación 3D unicelular asambleas, que son indispensables para el progreso en los campos de la biología celular y medicina regenerativa.
En una solución que contiene ningún polímero, las células repelen debido a la repulsión electrostática de la carga superficial, la fuerza de repulsión de la hidratación, el efecto de repulsión de glicocálix y ondulación de la membrana. Nuestro estudio anterior mostró que pares de células pueden ser estables durante mucho tiempo cuando las células se tratan con PEG. Lo más importante, el transporte exitoso de un par de célula a una región sin clavija, después las células se celebró en contacto durante 5 minutos en PEG, sugiere que el contacto celular se mantiene de forma estable. Esto está bien explicado en términos del efecto agotamiento del11, y esencialmente el mismo mecanismo se aplica a los conjuntos celulares mediante DEX9. Nuestros resultados actuales sugieren que otros tipos de macromoléculas naturales podrían utilizarse también para la construcción de asambleas celulares 3D estables.
Para el transporte rápido de las células, la concentración de polímero es importante. Generalmente, la viscosidad de la solución aumenta drásticamente cuando el polímero es disuelto por encima de la concentración de superposición. Bajo esta condición, es difícil manipular las células usando pinzas ópticas. Por lo tanto, el experimento debe ser realizado debajo de la concentración de superposición. Para una solución DEX, la concentración de superposición es aprox. 50 mg/mL (la viscosidad cinética es 5.5 mm2/s). Como se indica en la ref. 9, se observó una Asamblea celular estable cuando la concentración de DEX 10 mg/mL y 40 mg/mL. Este resultado sugiere que el efecto de agotamiento es lo suficientemente grande para mantener el contacto célula-célula estable incluso cuando la concentración de DEX es menor que la concentración de superposición. Se ha demostrado que la adición de DEX no afecta la viabilidad de las células hasta 40 mg/mL 9.
El establecimiento de un método para la construcción de asambleas celulares 3D es importante en el campo de la medicina regenerativa, desde mímico un en vivo microambiente celular por estructuración de las células puede facilitar el tejido derivado de células madre formación. Hasta ahora, hemos utilizado el presente Protocolo para la construcción de conjuntos celulares con Neuro2A células9 además de las células NMuMG. Esperamos establecer una metodología experimental para la construcción de asambleas celulares 3D de un mayor número de células de diferentes morfologías. El sistema de pinza óptica desarrollado por Ichikawa et al. 13 sería aplicable para este propósito ya que la orientación de las células puede ser controlada. Ensayos adicionales a lo largo de estas líneas deben ser prometedoras.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen su generosa asistencia con la instalación experimental Shu Hashimoto, Aoi Yoshida y Taeko Ohta Universidad de Doshisha. Este trabajo fue apoyado por KAKENHI (15H 02121, 15K 05400, 25103012, 50587441) y por el programa de MEXT-Supported para la Fundación de investigación estratégica en universidades privadas. Este estudio también fue apoyado por una beca Polaco saber (líder nacional centro de investigación) científico del consorcio de "Animal – seguro alimentos saludables", decisión del Ministerio de ciencia y educación superior no. 05-1/KNOW2/2015...
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope IX71 | Olympus | IX71 | |
| Dextran(200,000; molecular biology-grade) | Wako | CAS.NO 9004-54-0 | |
| Laser Trapping System (NanoTracker 2) | JPK Instruments | S/N T-05-0200 | |
| Upper Objective Lens | Olympus | LUMPLFLN60XW | |
| Lower Objective Lens | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Top Cover Glass | MATUNAMI | C022401 | |
| Intermediate Cover Glass (Spacer) | MATUNAMI | - | custom-made (size = 10mm×10mm, thickness = 0.17mm) |
| Bottom Cover Glass | MATUNAMI | C030401 | |
| Camera | The Imaging Source | DFK 31AF03 | |
| Software | JPK Instruments | NanoTracker2 PFM software | |
| NMuMG cells | RIKEN BRC | RCB2868 | |
| PBS | Wako | 166-23555 | |
| Cell banker | Nippon Zenyaku Kogyo | ZR621 | |
| D-MEM | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 044-29765 | |
| FBS | Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan | 172012-500ML | |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Wako Pure Chem. Ind., Japan | 161-23181 |
References
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