Eine Invasive Methode zur Aktivierung der Maus Dentate Gyrus durch hochfrequente Stimulation

Summary

Dieses Protokoll zeigt, wie eine zuverlässige HFS-Methode bei Mäusen einrichten. Neuronen in der hippocampal dentate Gyrus werden durch HFS direkt und indirekt in Vivoelektrisch stimuliert. Neuronale Aktivität und molekulare Signale werden vom c-fos und Notch1 immunofluorescent Färbung, geprüft; Neurogenese wird durch Bromodeoxyuridine Assay Kennzeichnung quantifiziert.

Abstract

Hochfrequenz-Elektrostimulation (HFS) mit implantierten Elektroden Ausrichtung auf verschiedene Gehirnregionen ist als eine wirksame Behandlung für verschiedene neurologische und psychiatrische Störungen nachgewiesen worden. HFS im tiefen Bereich des Gehirns, auch benannt Tiefe Hirnstimulation (DBS), wird in klinischen Studien immer wichtiger. Jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der Hochfrequenz-DBS (HF-DBS) Chirurgie hat damit begonnen, die Möglichkeit der Nutzung diese invasive Technik auf andere Situationen, wie z. B. die Behandlung von schweren Depressionen Störung (MDD), Zwangsstörungen (OCD), zu verbreiten und so auf.

Trotz dieser wachsenden Anzeichen bleiben die zugrunde liegenden Mechanismen die segensreiche Wirkungen von HF-DBS rätselhaft. Um diese Frage zu lösen, ist ein Ansatz, implantierte Elektroden verwenden, die spärlich verteilte Subpopulationen von Neuronen durch HFS aktivieren. Es wurde berichtet, dass HFS im anterioren Nucleus des Thalamus zur Behandlung der refraktären Epilepsie in der Klinik verwendet werden könnten. Die zugrunde liegenden Mechanismen könnten im Zusammenhang mit der erhöhten Neurogenese und neuronalen Aktivität verändert. Deshalb sind wir interessiert, die physiologischen Veränderungen durch die Erkennung von neuronaler Aktivität sowie Neurogenese bei der Maus dentate Gyrus (DG) vor und nach der Behandlung der HFS.

In diesem Manuskript beschreiben wir Methoden für HFS die Aktivierung der DG bei Mäusen, direkt oder indirekt und in akuter oder chronischer Weise ausrichten. Darüber hinaus beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Zubereitung von Gehirnscheiben für c-fos und Notch1 immunofluorescent Färbung um die neuronale Aktivität zu überwachen und Signalisierung Aktivierung und Bromodeoxyuridine (BrdU) beschriften, um festzustellen, die Neurogenese nach HF-DBS-Induktion. Die Aktivierung der neuronalen Aktivität und Neurogenese nach der HF-DBS-Behandlung bietet direkte neurobiologische Erkenntnisse und mögliche therapeutische Vorteile. Insbesondere kann diese Methodik verändert und auf anderen interessierten Gehirnregionen wie den Basalganglien und subthalamic Regionen für bestimmte Hirnerkrankungen in der Klinik angewendet werden.

Introduction

HF-DBS ist eine Neurochirurgische Technik für elektrische Stimulation des Gehirns, die seit den 1870er Jahren¹entwickelt wurde. In den späten 1980ern HFS diente zuerst als eine mögliche therapeutische Intervention für Morbus Parkinson und andere Bewegung Störungen². In den letzten Jahrzehnten hat HF-DBS mehr und mehr verbreitet in der Behandlung von Erkrankungen des Gehirns, die derzeit unheilbar sind durch eine traditionelle therapeutische Strategie. Insbesondere durch die genauigkeitsverbesserung der HFS-Elektrode, hochwirksame Resultate und minimalen Nebenwirkungen, die Zahl der Erkrankungen des Gehirns von HF-DBS behandelt deutlich gestiegen in den letzten Jahrzehnten^{3,4, 5}. Zum Beispiel wurde HF-DBS von der US Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung der Parkinson-Krankheit (PD), Typ Alzheimer Demenz, essentiellem Tremor und andere Arten von Bewegung Störungen^2,6, genehmigt ⁷. bei Parkinson-Patienten, die dopaminergen Medikation reduziert bis zu 50 % bei HF-DBS-⁸. Neben der erfolgreichen Behandlung von Bewegungsstörungen zeigen HF-DBS auch seine starke Effekte bei der Behandlung von psychiatrischen Erkrankungen in der Klinik und für kognitive Augmentation als gut^{2,9, 10 , 11}. es sollte angemerkt werden, dass die Erforschung der HFS für die Behandlung von anderen psychiatrischen Erkrankungen sind in verschiedenen Stadien, bietet viel versprechend für Patienten¹².

Obwohl viele Studien gezeigt haben, dass eine fokale HFS sowohl lokale als auch remote Auswirkungen im gesamten Gehirn¹³hat, bleiben die neurologischen und molekularen Mechanismen der Wirkung schwer fassbaren^2,14. In der Klinik gilt therapeutischen HF-DBS in der Regel in einer langfristigen Weise für die Behandlung der Parkinson-Krankheit und chronische Schmerzen, etc. , die viele Meinungen ausgelöst werden, um zu erklären, die Verbesserung, erzeugt durch eine HF-DBS-Behandlung, unter denen eine Möglichkeit dass der HFS-Strom der neuronalen Netzwerk-Aktivität, wahrscheinlich durch eine sich wiederholende Depolarisation der Axone in der Nähe der implantierten Elektrode HFS moduliert. Oder HF-DBS die Fördermenge der Ausgang Neuronen und die geplanten Ziele ändern können. Auch HF-DBS führen kann zu langfristigen synaptischen Veränderungen, einschließlich Langzeitpotenzierung (LTP) und langzeitdepression (LTD), die auf eine symptomatische Verbesserung beitragen kann. Bisher ist noch unklar, ob HFS Janin die wichtigsten molekularen Ereignisse, die regulieren zelluläre Prozesse wie als adulten Neurogenese in Vivo. Mehrere Zeilen von Studien haben gezeigt, dass HFS bei Nagetieren ähnliche Neuronale Reaktionen von klinisch angewandter DBS^15,16imitieren konnte. Um zu verstehen, die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen der HF-DBS, in dieser Studie richten wir zunächst eine in Vivo HFS Methodik bei Mäusen in einer akuten (ein Tag) oder chronische (fünf Tage) Art und Weise. Zweitens, richten wir eine Methodik der Aktivierung zu bestimmen, die Veränderung der neuronalen Aktivität und Neurogenese im Auslieferzustand eine HF-DBS.

Da die neuronale Produktion von neuralen Stammzellen während der embryonalen Entwicklung reichlich ist aber Erwachsenenlebens andauert, ist die hippocampale subgranular Zone eines der wichtigsten Gebiete wo die Neurogenese auftritt. Der Prozess der Neurogenese wird von vielen physiologischen und pathologischen Faktoren beeinflusst. In bestimmten epileptischen Fällen ist die hippocampale Neurogenese drastisch verringerte^17,18. Darüber hinaus konnte eine einzelne Elektrokrampftherapie die neuronale Produktion im dentate Gyrus¹⁹deutlich steigern. Diese Beobachtungen legen nahe, dass die elektrophysiologische Aktivität eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der adulten Neurogenese und Synaptische Plastizität in hippocampal Neuronen spielt. Daher, um die Auswirkungen von HF-DBS auf neuronaler Aktivität und Neurogenese unter Beweis zu stellen, wir führen zunächst eine Immunostaining Assay der unmittelbaren frühen gen (IEG)- c-fos ist ein bekannter Marker für kurzfristige neuronaler Aktivität infolge Erleben Sie²⁰. Notch1 Signalisierung wird auch erkannt, um die Signalisierung Aktivierung nach der HFS Lieferung^21,22zu überwachen. Darüber hinaus erkennen wir auch die neuronale Produktion durch eine BrdU Kennzeichnung Analyse nach der HF-DBS-Induktion in verschiedenen Manieren, obwohl BrdU Färbung auch als Marker für Gliogenesis sein kann.

In der vorliegenden Studie werden zwei HFS-Methoden, die Aktivierung der hippocampalen GD direkt und indirekt Zielen angepasst. Die Elektrode wird direkt in der DG implantiert oder in den Projektionen, die DG-Neuronen aktivieren sendet medialen Perforant Weg (PP) implantiert. Für die HF-DBS-Induktion ist eine programmierbare Stimulator für eine kontinuierliche Stimulation über die festen Elektrode auf den Kopf der Maus vorgestellt. Ermitteln Sie die Auswirkungen der HFS auf neuronalen Aktivierung und Neurogenese, erkennen wir den Ausdruck von c-fos und Notch1 durch immunofluorescent Färbung und die Anzahl der BrdU integriert positive Neuronen im Großraum hippocampal DG jeweils nach die HFS-Behandlung. Insbesondere werden die Auswirkungen von HF-DBS auf die Neurogenese in der DG zwischen dem eine akute und eine chronische Stimulation oder zwischen einer direkten und einer indirekten Stimulierung Weise bzw. verglichen.

Protocol

Tierische Verfahren experimentelle der institutionellen Richtlinien von der Beijing Institute of Basic Medical Sciences (Beijing, China) und der chinesischen staatlichen Regelungen für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die Mäuse (Erwachsene männlich, 26 ~ 30 g) untergebracht waren, und hielt bei einer konstanten Temperatur von 23 ° C, mit Wasser und Nahrung Ad Libitum, unter einen 12 h Licht/12-h dunklen Zyklus (Leuchten bei 07:00). Alle experimentelle Verfahren wurden während der Licht-Zyklus durc…

Representative Results

Im Anschluss an die HF-DBS-Stimulation der hippocampalen DG Subregion direkt oder PP Subregion im Hinblick auf die DG indirekt aktivieren über eingefügt Elektroden verwenden die stereotaktischen Anpassungen, die Nagetiere wurden mit Pentobarbital betäubt und beprobt 3 h nach der letzten HF-DBS-Stimulation für die c-fos und Notch1 Immunostaining. Für die BrdU Färbung, 36 h nach der letzten Injektion von BrdU nach 1 Tag oder 5 Tage der HF-DBS Stimulation, wurden die …

Discussion

Die HF-DBS-Technik hat als ein mächtiges Werkzeug für die Behandlung von vielen neurologischen Erkrankungen seit den 1990er Jahren verbreitet. Bisher ist das Wahrzeichen Werk von HF-DBS für die Behandlung von Parkinson und essentiellem Tremor, der viel Aufmerksamkeit und das Interesse sowohl in der Klinik und der wissenschaftlichen Gemeinschaft angezogen hat. Es gibt verschiedene Arten der laufenden HF-DBS-Studien von vielen Gruppen für HF-DBS therapeutische Anwendung bestimmte neurologische und psychiatrische Erkran…

Materials

Brain stereotaxic instrument	Stoelting	51730D	Stereotactic intracranial implantation for mouse
Stimulator	A-M systems	Model 3800	MultiStim 8-Channel programmable stimulator
Dental driller	Saeshin Precision Co., Ltd	STRONG 90	For drilling and crainiotomy
Burr	Meisinger	HM1 005#	For drilling and crainiotomy
Digidata 1550 Digitizer	Molecular Devices	AXON 1550	High-resolution data acquisition
Cryotome	Thermo Fisher Scientific	Thermo Cryotome FSE	Cutting frozen sections of specimens
Confocal microscope	Olympus	FV-1200	Japan, with 20x Objective (NA 0.45)
Mouse surgery tools	F.S.T.	14084-08,11254-20,16109-14	Scissors, forceps, bone cutter, holders etc.
Pentobarbital sodium	R&D systems	4579	20-50mg/kg for i.p. injection
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P3032	75,000 U for i.m. injection
Carprofen	Sigma-Aldrich	SML1713	5-10mg/kg, for s.c. injection
4% Paraformaldehyde (PFA)	Beijing Solarbio Sci-Tech Co.	P1110	stocking solution for tissue fixation
Phosphate buffer (PBS)	Invitrogen	10010023	pH7.4, 500ml in stocking
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura	4583	Formulation of water-soluble glycols and resins
anti-BrdU antibody	Abcam	ab6326	Dilutions:1/800
anti-c-fos antibody	Abcam	ab209794	Dilutions:1/500
Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A11036	Dilutions:1/500
Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488)	Jackson ImmunoResearch	712-546-150	Dilutions:1/500
Antifade mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Counterstaining with DAPI
anti-Notch1 antibody (C-20)	Santa Cruz Biotech	sc-6014	Dilutions:1/50
Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488)	Abcam	ab150073	Dilutions:1/1000