Un método invasivo para la activación de la convolución del cerebro dentada de ratón por el estímulo de alta frecuencia
Summary
Este protocolo muestra cómo establecer un método confiable de HFS en ratones. Las neuronas en el hipocampo giro dentado son estimuladas eléctricamente por HFS directamente e indirectamente en vivo. La actividad neuronal y señalización molecular son examinados por c-fos y coloración inmunofluorescente de Notch1, respectivamente; la neurogénesis se cuantifica por bromodeoxiuridina etiquetado ensayo.
Abstract
Estimulación eléctrica de alta frecuencia (HFS), usando electrodos implantados a varias regiones del cerebro, se ha demostrado como un eficaz tratamiento para diversos trastornos neurológicos y psiquiátricos. HFS en la región profunda del cerebro, también llamado estimulación cerebral profunda (DBS), se está convirtiendo en cada vez más importante en los ensayos clínicos. Avances recientes en el campo de la cirugía DBS (HF-DBS) de alta frecuencia ha comenzado a difundir la posibilidad de utilizar esta técnica invasiva a otras situaciones, tales como el tratamiento para el trastorno de depresión mayor (MDD), trastorno obsesivo-compulsivo (TOC) y así en.
A pesar de estas indicaciones de expansión, los mecanismos subyacentes de los efectos beneficiosos de la HF-DBS siguen siendo enigmáticos. Para abordar esta cuestión, un enfoque es utilizar electrodos implantados que activan escasamente distribuidas subpoblaciones de neuronas por HFS. Se ha divulgado que HFS en el núcleo anterior del tálamo puede ser utilizado para el tratamiento de epilepsia refractaria en la clínica. Los mecanismos subyacentes podrían estar relacionado con la neurogénesis aumento y alteración la actividad neuronal. Por lo tanto, estamos interesados en explorar las alteraciones fisiológicas por la detección de la actividad neuronal, así como la neurogénesis en el giro dentado (DG) de ratón, antes y después del tratamiento de HFS.
En este manuscrito, se describen metodologías para HFS a la activación de la dirección general en ratones, directa o indirectamente y de forma aguda o crónica. Además, se describe un protocolo detallado para la preparación de rodajas de cerebro de c-fos y Notch1 inmunofluorescente tinción para monitorear la actividad neuronal y activación de señalización y de bromodeoxiuridina (BrdU) etiquetado para determinar la neurogénesis después de la inducción HF-DBS. La activación de la actividad neuronal y de neurogénesis después del tratamiento de la HF-DBS ofrece evidencia neurobiológica directa y los posibles beneficios terapéuticos. Particularmente, esta metodología puede ser modificada y aplicada para llegar a otras regiones del cerebro interesado como los ganglios basales y regiones subtalámicos para los trastornos cerebrales específicos en la clínica.
Introduction
HF-DBS es una tecnología para la estimulación eléctrica en el cerebro, que se ha desarrollado desde la década de 18701. A finales de 1980, HFS primero fue utilizado como una potencial intervención terapéutica para la enfermedad de Parkinson y trastornos del otro movimiento2. En las últimas décadas, HF-DBS ha sido más ampliamente utilizado en el tratamiento de los trastornos cerebrales que son actualmente intratables por una estrategia terapéutica tradicional. En particular, debido a la mejora en la precisión del electrodo HFS, resultados altamente efectivos y efectos secundarios mínimos, el número de trastornos cerebrales tratados por HF-DBS ha aumentado significativamente en los últimos decenios3,4, 5. Por ejemplo, HF-DBS ha sido aprobado por la US Food y Drug Administration (FDA) para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson (EP), de tipo Alzheimer, temblor esencial y otros tipos de trastornos de movimiento2,6, 7. en pacientes con EP, la medicación dopaminérgica se reduce hasta un 50% durante8de HF-DBS. Además del tratamiento acertado de trastornos del movimiento, HF-DBS también ha demostrado sus efectos poderosos en el tratamiento de enfermedades psiquiátricas en la clínica y para el aumento cognitivo como bien2,9, 10 , 11. Cabe señalar que la investigación de HFS para el tratamiento de otros trastornos psiquiátricos están en varias etapas, que ofrece mucha promesa de pacientes12.
Aunque muchos estudios han demostrado que una focal HFS tiene efectos tanto locales como remotos a lo largo de los13del cerebro, los mecanismos neurológicos y moleculares de los efectos siguen siendo escurridizo2,14. En la clínica, terapéutica HF-DBS se suele aplicar de una manera a largo plazo para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, dolor crónico etc. que muchas opiniones se plantean para explicar la mejora generada por un tratamiento de la HF-DBS, entre que una posibilidad que la corriente HFS modula la actividad de la red neuronal, probablemente por una despolarización repetitiva de los axones en las inmediaciones del electrodo implantado de HFS. O, HF-DBS puede cambiar la tasa de descarga de las neuronas de salida y los objetivos previstos. También, HF-DBS puede conducir a cambios sinápticos a largo plazo, potenciación a largo plazo (LTP) y depresión a largo plazo (LTD), que puede contribuir a una mejora sintomática. Hasta ahora, es todavía incierto si HFS influencias los eventos moleculares claves que regulan el celular procesos tales como la neurogénesis adulta en vivo. Varias líneas de estudios han demostrado que el HFS en roedores podría imitar respuestas neurales similares de DBS clínicamente aplicada15,16. Para entender los mecanismos celulares subyacentes de HF-DBS, en este estudio, en primer lugar establecimos un en vivo metodología HFS en ratones en un agudo (un día) o de manera crónica (cinco días). En segundo lugar, hemos creado una metodología de análisis de activación para determinar la alteración de la actividad neuronal y de neurogénesis después de una entrega de HF-DBS.
Dado que la producción neuronal de las células madre neurales es abundante durante el desarrollo embrionario, pero continúa a lo largo de la vida adulta, la zona subgranular hipocampo es una de las principales zonas donde se produce la neurogénesis. El proceso de neurogénesis es influenciado por muchos factores fisiológicos y patológicos. En ciertos casos de epilepsia, la neurogénesis hipocampal es drásticamente disminuido17,18. Además, una sola terapia electroconvulsiva podría aumentar significativamente la producción neuronal en el giro dentado19. Estas observaciones sugieren que la actividad electrofisiológica juega un papel crítico en la regulación de la neurogénesis adulta y la plasticidad sináptica en neuronas hippocampal. Por lo tanto, para demostrar aún más los efectos del HF-DBS en la actividad neuronal y de neurogénesis, primero llevamos a cabo un ensayo de immunostaining de principios inmediatos gene (IEG) c-fos que es un conocido marcador de la actividad neuronal a corto plazo resultantes de Experiencia de20. Señalización Notch1 se detecta también a supervisar la activación de la señalización después de la entrega HFS21,22. Por otra parte, detectamos también la producción neuronal por un BrdU etiquetado análisis después de la inducción HF-DBS en diversas maneras, aunque la tinción de BrdU puede ser también un marcador para gliogenesis.
En el presente estudio, dos metodologías HFS se adaptan a la activación de la dirección general de hippocampal directa e indirectamente. El electrodo implantado directamente en la dirección general o implantado en el camino perforante medial (PP), que envía proyecciones a activar las neuronas DG. Para la inducción HF-DBS, un estimulador programable se presenta para un estímulo continuo a través del electrodo fijo sobre la cabeza de ratón. Para determinar los efectos de HFS en activación neuronal y de neurogénesis, detectamos la expresión de c-fos y Notch1 coloración inmunofluorescente y el número de neuronas positivas BrdU incorporada en la región hippocampal de la DG, respectivamente, después el tratamiento de HFS. Particularmente, los efectos del HF-DBS en la neurogénesis en la DG se comparan entre una aguda y una forma de estimulación crónica, o entre una directa y una manera de estimulación indirecta, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
La técnica HF-DBS ha sido ampliamente utilizada como una poderosa herramienta para el tratamiento de muchos trastornos neurológicos desde la década de 1990. Hasta ahora, el trabajo de la señal de HF-DBS es para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson y temblor esencial, que ha atraído mucha atención e interés tanto en la comunidad científica y clínica. Hay varios tipos de estudios en curso HF-DBS por muchos grupos para la aplicación terapéutica de HF-DBS en ciertos trastornos neurológicos y psiquiátrico…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China subvenciones 31522029, 31770929 y 31371149 (a Haitao Wu), programa 973 (2014CB542203) del programa estatal desarrollo clave para la investigación básica de China (Wu Haitao) y Grant Z161100000216154 de la Municipal de Beijing de ciencia y tecnología Comisión (Haitao Wu). Los autores agradecen a todos los miembros del laboratorio Haitao Wu para su estímulo y discusiones. Los autores están muy agradecidos a Zhenwei Liu por su ayuda con el aparato de depuración.
Materials
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
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