高周波刺激によるマウスの海馬歯状回の活性化のための侵襲的な方法
Summary
このプロトコルはマウスで信頼性の高い HFS メソッドを設定する方法を示しています。を通じて海馬歯状回の神経細胞は、HFS を直接および間接的に生体内で電気刺激します。神経活動と分子シグナリング、 c-fosと notch1 遺伝子の免疫蛍光染色でそれぞれチェックします。神経新生は、アッセイをラベリング ブロモデオキシウリジンによる定量化されます。
Abstract
電気高周波刺激 (HFS)、さまざまな脳領域をターゲット注入電極を使用しては、様々 な神経疾患、精神疾患の効果的な治療法として実証されています。深部脳刺激療法 (DBS) とも呼ばれます、脳の深部で HFS 臨床試験でますます重要になってきた。高周波 (HF DBS) 外科領域の最近の進歩は大鬱病障害 (MDD)、強迫性障害 (OCD) の治療など、その他の状況にこの侵襲的手法の利用可能性を普及し始めているので上。
これらの拡大の徴候にもかかわらず HF DBS の有益な効果のメカニズムに残る謎。この問題に対処するため 1 つのアプローチはまばら HFS によってニューロンの分散のサブポピュレーションをアクティブに注入電極を使用します。それは、診療所における難治てんかんの治療のため、視床の前核の HFS がされる可能性がありますが報告されています。基になるメカニズムは増加神経新生に関連するかもしれない、神経活動を変更します。したがって、HFS 治療前後 (DG) のマウスの海馬歯状回における神経新生と同様に、神経活動の検出による生理学的変化を探究することに興味を持っております。
本稿では、直接または間接的、急性または慢性的にマウスで DG の活性化をターゲットに HFS のための方法論について述べる.さらに、述べるは、 c-fosと notch1 遺伝子の神経の活動を監視する染色とシグナル伝達活性化蛍光ブロモデオキシウリジン (BrdU) を決定するためにラベル付け、脳スライスの準備のための詳しいプロトコル、HF DBS 誘導後の新生。HF DBS 治療後神経活動と神経の活性化は、神経生物学の直接証拠と潜在的な治療上の利点を提供します。特に、この方法論を変更し、大脳基底核などの他の興味がある頭脳領域とクリニック特定の脳障害に対する視床領域をターゲットに適用できます。
Introduction
HF DBS は、1870 年代1から培われた脳の電気刺激のため脳神経外科技術です。1980 年代後半に HFS がパーキンソン病の潜在的な治療的介入として使用された最初と他の運動障害2。過去数十年で、HF DBS 使用されていますより広く現在治療である脳疾患の治療に従来の治療方針で。特に、HFS 電極、非常に効果的な成果、最小限の副作用の精度向上のため、HF DBS によって扱われる脳疾患の大幅増えている過去数十年3,4、 5。HF DBS をパーキンソン病 (PD)、アルツハイマー型痴呆、本態性振戦、運動疾患2,6、の他の種類の治療のため米国食品医薬品局 (FDA) によって承認されているなど7。 ドーパミン作動性薬の削減 PD 患者における HF DBS8時 50% まで。運動障害の治療に加えて HF DBS はも2,9,として認知増強のため診療所で精神疾患の治療に強力な効果を示しています。10,11. HFS の他の精神疾患の治療のための研究は、さまざまな段階、患者12に多くの約束を提供することに注意してください。
多くの研究は焦点の HFS が脳13全体のローカルとリモートの両方の効果を持っていることを示している、とらえどころのない2,14のまま効果の神経学的および分子のメカニズムです。診療所で治療 HF DBS は、通常のパーキンソン病と慢性の痛みなど多くの意見がどの 1 つの可能性の間での HF DBS 治療によって生成される改善を説明する発生の治療のため長期的な方法で適用されます。現在の HFS は、変調注入の HFS 電極近傍における軸索の反復的な脱分極によって神経ネットワークの活動をおそらく。また、HF DBS は、出力ニューロンと投影のターゲットの吐出量を変更可能性があります。また、HF DBS をつながる可能性があります長期的なシナプスの変化によって、長期増強 (LTP) や長期抑圧 (LTD) などに症状の改善に貢献するかもしれない。ところ、それはまだ不明かどうか HFS influences 携帯を調節する分子のキーイベント処理など成体脳ニューロン新生の生体として。研究のいくつかの行は、齧歯動物の HFS が臨床的に応用の DBS15,16のと同様の神経応答を模倣可能性がありますを示しています。本研究では、HF DBS の基になる細胞メカニズムを理解するには、我々 最初にセットアップを生体内でHFS 方法論マウスで急性 (1 日) または慢性 (5 日間) さま。第二に、我々 は HF DBS 出産後神経と神経活動の変化を決定する化分析の方法論を設定します。
神経幹細胞から神経細胞の生産が萌芽期の開発の間に豊かなが、大人の生活の中で続けていることを考える、海馬顆粒ゾーンは細胞新生が発生する主要な領域の 1 つです。神経新生のプロセスは、多くの生理学的および病理学的要因の影響を受けます。特定のてんかんの場合は、海馬の神経新生は劇的に減少した17,18です。さらに、単一電気けいれん療法は、19海馬歯状回の神経細胞の生産を大幅に向上する可能性があります。電気生理学的活動が成体と海馬ニューロンのシナプス可塑性の調節に重要な役割を果たしていることが示唆されました。したがって、神経活動と神経新生に及ぼす HF DBS をさらに示すためには、まず実施から生じる短期的な神経活動のよく知られているマーカーは、即時初期遺伝子 (IEG) fosの免疫染色法20をが発生します。Notch1 遺伝子のシグナルが検出された HFS 配信21,22後シグナル伝達活性をモニターします。さらに、我々 は、BrdU 染色することもできます gliogenesis のマーカーが様々 な方法で HF DBS 誘導後分析をラベリング BrdU による神経の生産も検出します。
本研究では 2 つの HFS 方法は直接および間接的に海馬 DG の活性化をターゲットに適応されます。電極は DG に直接注入または DG の神経細胞をアクティブにする予測を送信内側貫通パス (PP) に移植しています。HF DBS 誘導プログラム可能な刺激は、マウスの頭の上に固定電極を連続刺激を介して提示されます。HFS の神経細胞の活性化と神経新生に及ぼす影響を決定する免疫蛍光染色と海馬 DG 地域における BrdU 組み込まれて肯定的なニューロン数c-fosと notch1 遺伝子の発現を検出後,HFS の治療。特に、HF DBS の DG における神経新生に及ぼす影響比較されます急性と慢性刺激方法または直接および間接的な刺激方法間それぞれ。
Protocol
Representative Results
Discussion
HF DBS 手法は、1990 年代以降多くの神経疾患の治療のための強力なツールとして広く使用されています。これまでのところ、HF DBS のランドマーク作業はパーキンソン病や本態性振戦、多くの関心とクリニックと科学的なコミュニティの両方の関心を集めているの治療。特定神経疾患、精神疾患32,33HF DBS 治療上の適用の多くのグループによって進行中?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
(ハイタオ呉) に中国から助成金 Z161100000216154 の基礎研究の状態主要な開発プログラムから 973 (2014CB542203) プログラムの 31522029、31770929、31371149 (ハイタオ呉) に中国の助成金の国家自然科学基金を支え、北京市科学技術委員会 (ハイタオ呉) に.著者は、彼らの励ましと議論ハイタオ呉研究所のすべてのメンバーをありがとうございます。著者は、装置をデバッグでご支援威劉に非常に感謝しています。
Materials
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
References
- Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Kohl, S., et al. Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review. BMC Psychiatry. 14, 214 (2014).
- Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression. Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).
- Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).
- Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).
- Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation for Parkinson’s disease and other movement disorders. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).
- Garcia, L., D’Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. High-frequency stimulation in Parkinson’s disease: more or less. Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).
- Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats. Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).
- Grubert, C., et al. Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation. The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).
- Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).
- McIntyre, C. C., Hahn, P. J. Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation. Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).
- Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. Sing the mind electric – principles of deep brain stimulation. European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).
- Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).
- Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (97), e52457 (2015).
- Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, 26-41 (2008).
- Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression. Behavioral and Brain Functions. 6, 35 (2010).
- Feng, S., et al. Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment. The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).
- Alberi, L., et al. Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks. Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).
- Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. A step-wise approach to deep brain stimulation in mice. Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).
- Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration. Journal of Visualized Experiments. (107), e53266 (2016).
- Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation. Journal of Visualized Experiments. (104), e53066 (2015).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6 (2007).
- McHugh, T. J., et al. Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network. Science. 317 (5834), 94-99 (2007).
- Gonzalez, C., et al. Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories. Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tse, N., et al. The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (94), e52220 (2014).
- Pizzolato, G., Mandat, T. Deep brain stimulation for movement disorders. Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2 (2012).
- Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).
- Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer’s disease. Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).
- Min, H. K., et al. Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals. NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).
- Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. . RNA sequencing and analysis. 2015 (11), 951-969 (2015).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Frontiers in Neural Circuits. 8, 37 (2014).
- Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).
- Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
