Un metodo invasivo per l'attivazione della circonvoluzione dentata del Mouse dalla stimolazione ad alta frequenza
Summary
Questo protocollo viene illustrato come impostare un metodo affidabile di HFS in topi. Neuroni nel giro dentato dell’ippocampo sono stimolati elettricamente da HFS direttamente e indirettamente in vivo. Attività neuronale e induzione di segnali molecolari sono esaminate dal c-fos e macchiatura immunofluorescente Notch1, rispettivamente; neurogenesi è quantificata mediante analisi di etichettatura della bromodeossiuridina.
Abstract
Stimolazione elettrica ad alta frequenza (HFS), utilizzando elettrodi impiantati in varie regioni del cervello, il targeting è stata dimostrata come un efficace trattamento per vari disturbi neurologici e psichiatrici. HFS nella regione profonda del cervello, anche denominato stimolazione cerebrale profonda (DBS), sta diventando sempre più importante negli studi clinici. Recenti progressi nel campo della chirurgia DBS (HF-DBS) ad alta frequenza ha iniziato a diffondersi la possibilità di utilizzare questa tecnica invasiva ad altre situazioni, come trattamento per il disturbo di depressione maggiore (MDD), disturbo ossessivo-compulsivo (OCD) e così su.
Nonostante queste indicazioni in espansione, i meccanismi degli effetti benefici di HF-DBS rimangono enigmatici. Per rispondere a questa domanda, un approccio consiste nell’utilizzare elettrodi impiantati che attivano scarsamente distribuite sottopopolazioni di neuroni di HFS. È stato segnalato che HFS nel nucleo anteriore del talamo potrebbe essere usato per il trattamento dell’epilessia refrattaria in clinica. I meccanismi di fondo potrebbero essere collegati con il neurogenesis aumentato e alterata attività neuronale. Pertanto, siamo interessati ad esplorare le alterazioni fisiologiche tramite la rilevazione di attività neuronale, come pure la neurogenesi nel giro dentato (DG) del mouse prima e dopo trattamento di HFS.
In questo manoscritto, descriviamo metodologie per HFS indirizzare l’attivazione della DG in topi, direttamente o indirettamente e in maniera acuta o cronica. In più, descriviamo un protocollo dettagliato per la preparazione di fette del cervello per c-fos e Notch1 immunofluorescente macchiatura per monitorare l’attività neuronale e l’attivazione di segnalazione e per bromodeossiuridina (BrdU) etichettatura per determinare la neurogenesi dopo l’induzione HF-DBS. L’attivazione dell’attività neuronale e neurogenesi dopo il trattamento di HF-DBS fornisce la prova diretta neurobiologica e potenziali benefici terapeutici. In particolare, questa metodologia può essere modificata e applicata per altre regioni del cervello interessati quali i gangli basali e subtalamica regioni per disturbi cerebrali specifiche nella clinica di destinazione.
Introduction
HF-DBS è una tecnologia neurochirurgica per la stimolazione elettrica del cervello, che è stato sviluppato dal 1870s1. Nel tardo 1980, HFS venne usata come intervento terapeutico potenziale per il morbo di Parkinson e disordini di altri movimento2. Negli ultimi decenni, HF-DBS è stato più ampiamente utilizzato nel trattamento dei disordini del cervello che sono attualmente incurabili di una strategia terapeutica tradizionale. In particolare, grazie al miglioramento della precisione dell’elettrodo HFS, i risultati altamente efficaci e gli effetti collaterali minimi, il numero di disturbi cerebrali trattati da HF-DBS ha aumentato significativamente negli ultimi decenni3,4, 5. Ad esempio, HF-DBS è stato approvato da la US Food and Drug Administration (FDA) per il trattamento della malattia di Parkinson (MDP), demenza di tipo Alzheimer, tremore essenziale e altri tipi di movimento disturbi2,6, 7. nei pazienti del Palladio, il farmaco dopaminergico è ridotto fino al 50% durante la HF-DBS8. Oltre il riuscito trattamento dei disordini di movimento, HF-DBS ha dimostrato anche i suoi potenti effetti nel trattamento di malattie psichiatriche nella clinica e per l’incremento cognitivo come ben2,9, 10 , 11. si deve osservare che la ricerca di HFS per il trattamento di altri disturbi psichiatrici sono in varie fasi, offrendo molta promessa a pazienti12.
Anche se molti studi hanno dimostrato che un HFS focale ha effetti sia locali che remoti in tutto il cervello13, i meccanismi neurologici e molecolari degli effetti rimangono sfuggente2,14. Nella clinica, terapeutica HF-DBS è solitamente applicato in un modo a lungo termine per il trattamento del morbo di Parkinson e dolore cronico, ecc. , che molte opinioni sono sollevate per spiegare il miglioramento generato da un trattamento di HF-DBS, tra cui una possibilità che la corrente HFS modula l’attività di rete neuronale, probabilmente da una depolarizzazione ripetitiva degli assoni in prossimità dell’elettrodo HFS impiantato. In alternativa, HF-DBS possono modificare il tasso di scarico di neuroni di output e gli obiettivi previsti. Inoltre, HF-DBS può portare a cambiamenti sinaptici a lungo termine, tra cui Long-term potentiation (LTP) e depressione a lungo termine (LTD), che può contribuire a un miglioramento sintomatico. Finora, non è ancora chiaro se tali processi di HFS influenze chiavi eventi molecolari che regolano il cellulare come nella neurogenesi adulta in vivo. Parecchie linee di studi hanno dimostrato che HFS in roditori potrebbero imitare simili risposte neurali di clinicamente applicata DBS15,16. Per comprendere i meccanismi cellulari di HF-DBS, in questo studio, abbiamo innanzitutto impostare un in vivo metodologia HFS nei topi in un acuto (un giorno) o cronica (cinque giorni) modo. In secondo luogo, abbiamo istituito una metodologia di analisi di attivazione per determinare l’alterazione dell’attività neuronale e neurogenesi dopo una consegna di HF-DBS.
Dato che la produzione di un neurone da cellule staminali neurali è abbondante durante lo sviluppo embrionale ma continua per tutta la vita adulta, la zona subgranulare hippocampal è una delle principali aree dove si verifica la neurogenesi. Il processo di neurogenesi è influenzato da molti fattori fisiologici e patologici. In alcuni casi epilettici, il neurogenesis hippocampal è drammaticamente in diminuzione17,18. Inoltre, una singola terapia electroconvulsive potrebbe aumentare considerevolmente la produzione neuronale nel giro dentato19. Queste osservazioni suggeriscono che l’attività elettrofisiologica svolge un ruolo critico nella regolazione della neurogenesi adulta e plasticità sinaptica nei neuroni dell’ippocampo. Pertanto, per illustrare ulteriormente gli effetti di HF-DBS sull’attività neuronale e neurogenesi, prima eseguiamo un’analisi immunostaining del inizio immediato gene (IEG) c-fos che è un indicatore ben noto dell’attività neuronale a breve termine derivanti da Esperienza di20. Segnalazione di Notch1 viene rilevato anche per monitorare l’attivazione di segnalazione dopo il HFS consegna21,22. Inoltre, rileviamo anche la produzione di un neurone di un BrdU etichettatura analisi dopo l’induzione HF-DBS in vari modi, anche se BrdU colorazione può anche essere un indicatore per gliogenesis.
Nello studio presente, due metodologie di HFS sono adattati per l’attivazione della DG hippocampal di destinazione direttamente e indirettamente. L’elettrodo è impiantato nella DG direttamente o impiantato nel percorso perforant mediale (PP) che invia proiezioni per attivare i neuroni DG. Per l’induzione HF-DBS, uno stimolatore programmabile è presentato per una stimolazione continua attraverso l’elettrodo fisso sulla testa del mouse. Per determinare gli effetti di HFS su attivazione neuronale e neurogenesi, rileviamo l’espressione di c-fos e Notch1 dalla macchiatura immunofluorescente e il numero di neuroni positivi incorporato BrdU DG della regione ippocampale, rispettivamente, dopo il trattamento di HFS. In particolare, gli effetti del HF-DBS sulla neurogenesi nella DG vengono confrontati tra un acuto e un modo di stimolazione cronica, o tra un telefono e un modo di stimolazione indiretta, rispettivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnica di HF-DBS è stato ampiamente utilizzata come un potente strumento per il trattamento di molti disturbi neurologici dal 1990. Finora, il lavoro di pietra miliare di HF-DBS è per il trattamento della malattia di Parkinson e tremore essenziale, che ha attirato molta attenzione e interesse sia nella comunità scientifica e clinica. Ci sono vari tipi di studi di HF-DBS in corso da molti gruppi per applicazione terapeutica di HF-DBS in alcuni disturbi neurologici e psichiatrici32,</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supportato dalla Fondazione nazionale di scienze naturali di sovvenzioni Cina 31522029, 31770929 e 31371149 (a Haitao Wu), programma 973 (2014CB542203) dal programma di sviluppo chiave dello stato per la ricerca di base della Cina (a Haitao Wu) e Grant Z161100000216154 dalla Beijing Municipal scienza e tecnologia della Commissione (a Haitao Wu). Gli autori ringraziano tutti i membri del laboratorio Haitao Wu per il loro incoraggiamento e discussioni. Gli autori sono estremamente grati al Zhenwei Liu per il suo aiuto con l’apparato di debug.
Materials
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
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