माउस के सक्रियकरण के लिए एक इनवेसिव विधि उच्च आवृत्ति उत्तेजना द्वारा Dentate गाइरस
Summary
इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे चूहों में एक विश्वसनीय HFS विधि स्थापित करने के लिए । हिप्पोकैम्पस dentate गाइरस भर में ंयूरॉंस विद्युत सीधे और vivo मेंपरोक्ष रूप से HFS द्वारा उत्तेजित कर रहे हैं । न्यूरॉन गतिविधि और आणविक संकेतन द्वारा जांच कर रहे हैं सी-फोस और Notch1 immunofluorescent धुंधला, क्रमशः; neurogenesis को bromodeoxyuridine लेबलिंग परख कर quantified है ।
Abstract
विद्युत उच्च आवृत्ति उत्तेजना (HFS), प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड का उपयोग विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित, विभिन्न स्नायविक और मनोरोग विकारों के लिए एक प्रभावी उपचार के रूप में सिद्ध किया गया है. मस्तिष्क के गहरे क्षेत्र में HFS, भी गहरे मस्तिष्क उत्तेजना (डीबीएस) नाम, नैदानिक परीक्षणों में तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है. उच्च आवृत्ति डीबीएस (HF-डीबीएस) सर्जरी के क्षेत्र में हाल ही में प्रगति इस तरह के प्रमुख अवसाद विकार (MDD), जुनूनी बाध्यकारी विकार (ओसीडी) के लिए उपचार के रूप में अंय स्थितियों के लिए इस इनवेसिव तकनीक के उपयोग की संभावना फैल शुरू हो गया है, और इसलिए पर.
इन विस्तार संकेत के बावजूद, HF-डीबीएस के लाभकारी प्रभाव के अंतर्निहित तंत्र रहस्यपूर्ण रहते हैं । इस सवाल का पता करने के लिए, एक दृष्टिकोण प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड का उपयोग करने के लिए है कि विरल HFS द्वारा न्यूरॉन्स की वितरित उपआबादी को सक्रिय. यह बताया गया है कि thalamus के पूर्वकाल नाभिक में HFS क्लिनिक में दुर्दम्य मिर्गी के उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंतर्निहित तंत्र की वृद्धि हुई neurogenesis और बदल ंयूरॉंस गतिविधि से संबंधित हो सकता है । इसलिए, हम ंयूरॉन गतिविधि का पता लगाने के द्वारा शारीरिक परिवर्तन की खोज में रुचि रखते है और साथ ही माउस dentate गाइरस (डीजी) में neurogenesis से पहले और बाद HFS उपचार ।
इस पांडुलिपि में, हम HFS के लिए तरीकों का वर्णन करने के लिए चूहों में डीजी के सक्रियकरण लक्ष्य, प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से और एक तीव्र या जीर्ण तरीके से । इसके अलावा, हम के लिए मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन c-फोस और Notch1 immunofluorescent के लिए ंयूरॉंस गतिविधि और संकेतन सक्रियण की निगरानी और bromodeoxyuridine (BrdU) लेबलिंग के लिए निर्धारित करने के लिए HF-डीबीएस प्रेरण के बाद neurogenesis । HF-डीबीएस उपचार के बाद न्यूरॉन गतिविधि और neurogenesis के सक्रियण प्रत्यक्ष neurobiological सबूत और संभावित चिकित्सीय लाभ प्रदान करता है । विशेष रूप से, इस पद्धति को संशोधित किया जा सकता है और क्लिनिक में विशिष्ट मस्तिष्क विकारों के लिए बेसल गैंग्लिया और subthalamic क्षेत्रों के रूप में अन्य रुचि मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए लागू.
Introduction
HF-डीबीएस मस्तिष्क, जो 1870 के बाद से विकसित किया गया है में बिजली की उत्तेजना के लिए एक तंत्रिकाशल्यक प्रौद्योगिकी है1। 1980 के दशक में, HFS पहले पार्किंसंस रोग और अंय आंदोलन विकारों के लिए एक संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप के रूप में इस्तेमाल किया गया था2। पिछले कुछ दशकों में, HF-डीबीएस गया है अधिक से अधिक व्यापक रूप से मस्तिष्क विकारों जो वर्तमान में एक पारंपरिक उपचारात्मक रणनीति द्वारा इलाज कर रहे है के इलाज में इस्तेमाल किया । विशेष रूप से, HFS इलेक्ट्रोड की सटीकता में सुधार करने के लिए कारण, अत्यधिक प्रभावी परिणाम, और न्यूनतम साइड इफेक्ट, HF द्वारा इलाज मस्तिष्क विकारों की संख्या-डीबीएस काफी पिछले दशकों में वृद्धि हुई है3,4, 5. उदाहरण के लिए, HF-डीबीएस को पार्किंसंस रोग (पीडी) के उपचार के लिए अमेरिकी खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) द्वारा अनुमोदित किया गया है, अल्जाइमर प्रकार मनोभ्रंश, आवश्यक कंपन, और आंदोलन विकारों के अन्य प्रकार2,6, 7. पीडी रोगियों में, dopaminergic दवा HF-डीबीएस8के दौरान ५०% तक कम है । आंदोलन विकारों के सफल उपचार के अलावा, HF-डीबीएस भी क्लिनिक में मनोरोग रोगों के उपचार में अपने शक्तिशाली प्रभाव का प्रदर्शन किया है, और संज्ञानात्मक वृद्धि के लिए के रूप में अच्छी तरह से2,9, 10 , 11. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अन्य मनोरोग विकारों के उपचार के लिए HFS के अनुसंधान विभिन्न चरणों में हैं,12रोगियों के लिए बहुत वादे की पेशकश.
हालांकि कई अध्ययनों से यह प्रदर्शित किया है कि एक फोकल HFS दोनों मस्तिष्क13में स्थानीय और दूरदराज के प्रभाव है, प्रभाव के स्नायविक और आणविक तंत्र2,14मायावी रहते हैं । क्लिनिक में, चिकित्सीय HF-डीबीएस आम तौर पर पार्किंसंस रोग और पुराने दर्द के उपचार के लिए एक दीर्घकालिक तरीके से लागू किया जाता है, आदि कई राय एक HF-डीबीएस उपचार द्वारा उत्पन्न सुधार समझाने के लिए उठाया जाता है, जो बीच में एक संभावना कि HFS वर्तमान में axons के एक दोहराव से प्रत्यारोपित HFS इलेक्ट्रोड के आसपास के क्षेत्र में, ंयूरॉंस नेटवर्क गतिविधि, शायद संग्राहक । या, HF-डीबीएस उत्पादन ंयूरॉंस और अनुमानित लक्ष्य की निर्वहन दर बदल सकते हैं । इसके अलावा, HF-डीबीएस लंबी अवधि के synaptic परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, दीर्घकालिक potentiation (LTP) और दीर्घकालिक अवसाद (लिमिटेड), जिसमें एक रोगसूचक सुधार करने के लिए योगदान कर सकते हैं । अब तक, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि HFS influences प्रमुख आणविक घटनाओं कि vivo मेंवयस्क neurogenesis जैसे सेलुलर प्रक्रियाओं को विनियमित । अध्ययनों की कई लाइनें दिखा दिया है कि कुतर में HFS नैदानिक लागू डीबीएस के समान तंत्रिका प्रतिक्रियाओं की नकल कर सकता है15,16। HF-डीबीएस के अंतर्निहित सेलुलर तंत्र को समझने के लिए, इस अध्ययन में, हम पहले एक तीव्र (एक दिन) या जीर्ण (पांच दिन) तरीके से चूहों में vivo HFS पद्धति में एक सेट. दूसरे, हम एक HF-डीबीएस वितरण के बाद न्यूरॉन गतिविधि और neurogenesis के परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए एक सक्रियकरण विश्लेषण पद्धति की स्थापना की ।
यह देखते हुए कि तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं से ंयूरॉन उत्पादन भ्रूण विकास के दौरान प्रचुर मात्रा में है, लेकिन वयस्क जीवन भर में जारी है, हिप्पोकैम्पस उपदानेदार क्षेत्र प्रमुख क्षेत्रों में से एक है जहां neurogenesis होता है । neurogenesis की प्रक्रिया कई शारीरिक और रोग कारकों से प्रभावित है । कुछ मिरगी मामलों में, हिप्पोकैम्पस neurogenesis नाटकीय रूप से17,18में कमी आई है । इसके अलावा, एक एकल electroconvulsive चिकित्सा काफी dentate गाइरस में ंयूरॉन उत्पादन में वृद्धि कर सकता है19। इन टिप्पणियों का सुझाव है कि electrophysiological गतिविधि हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स में वयस्क neurogenesis और synaptic प्लास्टिक के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इसलिए, आगे HF के प्रभाव-ंयूरॉन गतिविधि और neurogenesis पर डीबीएस प्रदर्शित करने के लिए, हम पहले बाहर तत्काल जल्दी जीन (IEG) सी-फोस जो अल्पावधि के एक प्रसिद्ध मार्कर है के एक immunostaining परख ले के परिणामस्वरूप ंयूरॉन गतिविधि से उत्पंन 20का अनुभव । Notch1 सिग्नलिंग को HFS डिलिवरी21,22के बाद सिग्नलिंग सक्रियण पर नजर रखने के लिए भी पता चला है । इसके अलावा, हम भी विभिंन शिष्टाचार में HF-डीबीएस प्रेरण के बाद एक BrdU लेबलिंग विश्लेषण द्वारा ंयूरॉन उत्पादन का पता लगाने, हालांकि BrdU धुंधला भी gliogenesis के लिए एक मार्कर हो सकता है ।
वर्तमान अध्ययन में, दो HFS के तरीकों को हिप्पोकैम्पस महानिदेशक के सक्रियण लक्ष्य प्रत्यक्ष और परोक्ष रूप से अनुकूलित कर रहे हैं । इलेक्ट्रोड को सीधे डीजी में प्रत्यारोपित या औसत दर्जे का perforant पथ (पीपी) में प्रत्यारोपित कर दिया जाता है जो डीजी न्यूरॉन्स को सक्रिय करने के लिए अनुमानों को भेजता है । HF-डीबीएस प्रेरण के लिए, एक प्रोग्राम उत्तेजित करने के लिए माउस सिर पर तय इलेक्ट्रोड के माध्यम से एक सतत उत्तेजना के लिए प्रस्तुत किया जाता है । न्यूरॉन सक्रियण और neurogenesis पर HFS के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए, हम immunofluorescent और BrdU महानिदेशक क्षेत्र में हिप्पोकैम्पस-शामिल सकारात्मक न्यूरॉन्स की संख्या, क्रमशः के बाद, फोस और Notch1 की अभिव्यक्ति का पता लगाने. HFS उपचार । विशेष रूप से, HF के प्रभाव-neurogenesis पर डीबीएस के डीजी में एक तीव्र और एक पुरानी उत्तेजना तरीके के बीच तुलना कर रहे हैं, या एक प्रत्यक्ष और एक अप्रत्यक्ष उत्तेजना तरीके के बीच, क्रमशः ।
Protocol
Representative Results
Discussion
HF-डीबीएस तकनीक व्यापक रूप से 1990 के दशक के बाद से कई स्नायविक विकारों के उपचार के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है । अब तक, HF के मील का पत्थर काम-डीबीएस पार्किंसंस रोग और आवश्यक कंपन है, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित ३१५२२०२९, ३१७७०९२९ और ३१३७११४९ (Haitao वू करने के लिए), कार्यक्रम ९७३ (2014CB542203) चीन के बुनियादी अनुसंधान के लिए राज्य कुंजी विकास कार्यक्रम से (Haitao वू करने के लिए), और अनुदान Z161100000216154 से बीजिंग नगर विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (Haitao वू करने के लिए) । लेखकों ने Haitao वू लेबोरेटरी के सभी सदस्यों को उनके प्रोत्साहन और विचार-विमर्श के लिए धन्यवाद दिया । लेखक तंत्र debugging के साथ उनकी मदद के लिए Zhenwei लियू के लिए अत्यंत आभारी हैं ।
Materials
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
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