En invasiv metode for aktivering av musen Dentate Gyrus av høyfrekvente stimulering
Summary
Denne protokollen viser hvordan du setter opp en pålitelig HFS metode i mus. Nerveceller i hele den hippocampus dentate gyrus stimulert elektrisk av HFS direkte og indirekte i vivo. Neuronal aktivitet og molekylære signalene er undersøkt av c-fos og Notch1 immunofluorescent flekker, henholdsvis; neurogenesis er kvantifisert ved bromodeoxyuridine merking analysen.
Abstract
Elektrisk høyfrekvente stimulering (HFS), bruke implanterte elektroder målretting ulike områder av hjernen, har vist seg som en effektiv behandling for ulike nevrologiske og psykiske lidelser. HFS i dyp regionen av hjernen, også kalt dyp hjernestimulasjon (DBS), blir stadig viktigere i kliniske forsøk. Framskritt innen høyfrekvente DBS (HF-DBS) kirurgi har begynt å spre muligheten for å utnytte denne invasiv teknikken til andre situasjoner, for eksempel behandling for store depresjonen lidelse (MDD), Tvangslidelser (OCD), og så på.
Til tross for disse voksende indikasjoner forblir de underliggende mekanismene for de gunstige virkningene av HF-DBS gåtefull. For å løse dette spørsmålet, er en tilnærming å bruke implanterte elektroder tynt aktivere distribuert subpopulasjoner av neurons ved HFS. Det har blitt rapportert at HFS i fremre kjernen av thalamus kan brukes for behandling av ildfaste epilepsi i klinikken. De underliggende mekanismene kan være knyttet til økt neurogenesis og forandret neuronal aktivitet. Derfor er vi interessert i å utforske de fysiologiske endringene av gjenkjenning av neuronal aktivitet samt neurogenesis i musen dentate gyrus (DG) før og etter HFS behandling.
I dette manuskriptet beskriver vi metoder for HFS målrette aktivering av DG i mus, direkte eller indirekte og i en akutt eller kronisk måte. I tillegg beskriver vi en detaljert protokoll forberedelse til hjernen skiver for c-fos og Notch1 immunofluorescent flekker for å overvåke neuronal aktiviteten og signalering aktivisering og bromodeoxyuridine (BrdU) for å avgjøre den neurogenesis etter HF-DBS induksjon. Aktivering av neuronal aktivitet og neurogenesis behandlingen HF-DBS gir direkte nevrobiologiske bevis og potensielle terapeutiske fordelene. Spesielt kan denne metodikken endres og brukes til å målrette andre områder av interessert hjernen som det basal Ganglion og subthalamicus områder for spesifikke hjernens lidelser i klinikken.
Introduction
HF-DBS er en neurosurgical teknologi for elektrisk stimulering i hjernen, som er utviklet siden 1870-tallet1. I slutten av 1980, HFS ble først brukt som en potensiell terapeutisk intervensjon for Parkinsons sykdom og andre bevegelser lidelser2. I de siste tiårene, har HF-DBS vært mer mye brukt i behandlingen av hjernen lidelser som er for tiden botemiddel ved en tradisjonell terapeutiske strategi. Spesielt på grunn av nøyaktighet forbedring av HFS elektroden, effektive resultater og minimale bivirkninger, hjernen lidelser behandlet av HF-DBS har betydelig økt siste tiårene3,4, 5. For eksempel er HF-DBS godkjent av US Food and Drug Administration (FDA) for behandling av Parkinson’s sykdom, Alzheimers type demens, viktig tremor og andre typer bevegelse lidelser2,6, 7. i PD pasienter, dopaminergic medisiner er redusert opptil 50% under HF-DBS8. I tillegg til vellykket behandling av bevegelsesforstyrrelser, har HF-DBS også vist sin kraftig effekt i behandling av psykiske lidelser i klinikken og kognitive augmentation som vel2,9, 10 , 11. det bør bemerkes at forskning HFS for behandling av andre psykiske lidelser er i ulike stadier, tilbyr mye løfte til pasienter12.
Selv om mange studier har vist at en fokal HFS har både lokale og eksterne effekter i hele hjernen13, forblir nevrologiske og molekylære mekanismer for effektene unnvikende2,14. I klinikken brukes terapeutiske HF-DBS vanligvis på en langsiktig måte for behandling av Parkinsons sykdom og kronisk smerte, etc. mange meninger er oppdratt til å forklare forbedring generert av en HF-DBS behandling, som en mulighet at HFS gjeldende modulerer nevrale nettverk aktiviteten, sannsynligvis av en repeterende depolarization av axons i implantert HFS elektroden. Eller HF-DBS endres utslipp frekvensen av utdata neurons og de beregnede målene. Også HF-DBS kan føre til langsiktige synaptic endringer, inkludert langsiktige potensiering (LTP) og langsiktig depresjon (LTD), som kan bidra til en symptomatisk forbedring. Så langt det er fortsatt uklart om HFS influences nøkkel molekylære hendelsene som regulere cellular prosesser slik som voksen neurogenesis i vivo. Flere linjer av studier har vist at HFS i gnagere kunne gjengi lignende nevrale svar klinisk anvendt DBS15,16. For å forstå de underliggende cellulære mekanismene av HF-DBS, i denne studien definere vi først en i vivo HFS metodikk i mus i akutt (en dag) eller kronisk (fem dager) måte. Dernest satt vi opp en aktivisering analyse-metodikken å bestemme endring av neuronal aktivitet og neurogenesis etter en HF-DBS levering.
Gitt at neuronal produksjonen fra nevrale stamceller er rikelig under embryonale utviklingen, men fortsetter hele voksenlivet, er hippocampus subgranular sonen en av de viktigste områdene hvor neurogenesis oppstår. Prosessen med neurogenesis påvirkes av mange fysiologiske og patologiske faktorer. I enkelte epileptiske tilfeller er hippocampus neurogenesis dramatisk redusert17,18. I tillegg kan en enkelt Elektrosjokkterapi betydelig øke neuronal produksjonen i dentate gyrus19. Disse observasjonene foreslår at elektrofysiologiske aktiviteten spiller en avgjørende rolle i regulering av voksen neurogenesis og synaptiske plastisitet i hippocampus neurons. Derfor, for å ytterligere vise effekten av HF-DBS på neuronal aktivitet og neurogenesis, vi først gjennomføre immunostai-analysen av den umiddelbare tidlig genet (IEG) c-fos som er en velkjent kortsiktige neuronal aktivitet skyldes Opplev20. Notch1 signalering registreres også overvåke signalnettverk aktivering etter at HFS levering21,22. Dessuten, vi også merker neuronal produksjonen av en BrdU merking analyse etter HF-DBS induksjon på ulike måter, om BrdU flekker kan også være en markør for gliogenesis.
Studien er to HFS metoder tilpasset å målrette aktivering av hippocampus DG direkte og indirekte. Elektroden er implantert inn i DG direkte eller implantert i mediale perforant banen (PP) som sender anslag aktivere DG neurons. For HF-DBS induksjon presenteres en programmerbar stimulator for en kontinuerlig stimulering via fast elektroden på mus hodet. For å fastslå effekten av HFS på neuronal aktivisering og neurogenesis, vi oppdager uttrykk for c-fos og Notch1 av immunofluorescent flekker og antall BrdU-innlemmet positiv nevroner i hippocampus DG regionen, henholdsvis etter HFS behandling. Spesielt sammenlignes effekten av HF-DBS på neurogenesis i DG mellom en akutt og en kronisk stimulering måte, eller mellom en direkte og en indirekte stimulering måte, henholdsvis.
Protocol
Representative Results
Discussion
HF-DBS teknikken har vært mye brukt som et kraftig verktøy for behandling av mange nevrologiske lidelser siden 1990. Så langt, er landemerke arbeidet med HF-DBS for behandling av Parkinsons sykdom og viktig tremor, som har tiltrukket seg mye oppmerksomhet og interesse både klinikken og vitenskapelige samfunn. Det finnes ulike typer pågående HF-DBS studier av mange grupper for HF-DBS terapeutisk program visse nevrologiske og psykiske lidelser32,33. Noen av d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Støttet av National Natural Science Foundation av Kina tilskudd 31522029, 31770929 og 31371149 (å Haitao Wu), programmet 973 (2014CB542203) fra den statlige nøkkel utviklingsprogrammet for grunnleggende forskning fra Kina (på Haitao Wu), og gi Z161100000216154 fra den Beijing kommunale vitenskap og teknologi-kommisjonen (Haitao Wu). Forfatterne takker alle medlemmer av Haitao Wu laboratoriet for oppmuntring og diskusjoner. Forfatterne er ekstremt takknemlig til Zhenwei Liu for hans hjelp med feilsøking apparatet.
Materials
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
References
- Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Kohl, S., et al. Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review. BMC Psychiatry. 14, 214 (2014).
- Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression. Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).
- Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).
- Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).
- Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation for Parkinson’s disease and other movement disorders. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).
- Garcia, L., D’Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. High-frequency stimulation in Parkinson’s disease: more or less. Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).
- Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats. Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).
- Grubert, C., et al. Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation. The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).
- Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).
- McIntyre, C. C., Hahn, P. J. Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation. Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).
- Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. Sing the mind electric – principles of deep brain stimulation. European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).
- Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).
- Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (97), e52457 (2015).
- Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, 26-41 (2008).
- Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression. Behavioral and Brain Functions. 6, 35 (2010).
- Feng, S., et al. Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment. The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).
- Alberi, L., et al. Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks. Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).
- Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. A step-wise approach to deep brain stimulation in mice. Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).
- Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration. Journal of Visualized Experiments. (107), e53266 (2016).
- Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation. Journal of Visualized Experiments. (104), e53066 (2015).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6 (2007).
- McHugh, T. J., et al. Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network. Science. 317 (5834), 94-99 (2007).
- Gonzalez, C., et al. Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories. Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tse, N., et al. The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (94), e52220 (2014).
- Pizzolato, G., Mandat, T. Deep brain stimulation for movement disorders. Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2 (2012).
- Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).
- Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer’s disease. Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).
- Min, H. K., et al. Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals. NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).
- Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. . RNA sequencing and analysis. 2015 (11), 951-969 (2015).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Frontiers in Neural Circuits. 8, 37 (2014).
- Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).
- Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
