In Vivo Microdialysis methode voor het verzamelen van grote extracellulaire eiwitten van de interstitiële vloeistof van de hersenen met hoog-moleculair gewicht Cut-off Probes
Summary
In vivo microdialysis heeft ingeschakeld collectie van moleculen aanwezig in de interstitiële vloeistof van de hersenen (ISF) van wakker, vrij-gedragen dieren. Om te analyseren relatief grote moleculen in ISF, het huidige artikel richt zich specifiek op het microdialysis protocol sondes met ultrahoog moleculair gewicht afgesneden membranen.
Abstract
In vivo microdialysis is een krachtige techniek voor het verzamelen van ISF van wakker, vrij-gedragen dieren gebaseerd op het beginsel van een dialyse. Terwijl microdialysis een gevestigde methode die relatief kleine molecules, zoals aminozuren of neurotransmitters maatregelen is, is het onlangs gebruikt om te beoordelen ook dynamica van grotere moleculen in ISF sondes met ultrahoog moleculair gewicht afgesneden membranen. Op het gebruik van dergelijke sondes, moet microdialysis worden uitgevoerd in een push-pull-modus om te voorkomen dat druk opgebouwd binnenkant van de sondes. Dit artikel bevat stapsgewijze protocollen zoals stereotaxic chirurgie en microdialysis lijnen instellen voor het verzamelen van eiwitten van ISF. Tijdens microdialysis, kunnen drugs worden toegediend hetzij systemisch, hetzij door directe infusie in ISF. Omgekeerde microdialysis is een techniek om direct inblazen ISF verbindingen. Integratie van drugs in de microdialysis perfusie buffer hen in staat stelt om te verspreiden in ISF via de sondes terwijl gelijktijdig het verzamelen van ISF. Door het meten van tau-eiwit als voorbeeld, toont de auteur aan hoe haar niveau op stimulerende Neuronale activiteit worden gewijzigd door omgekeerde microdialysis van picrotoxin. Voordelen en beperkingen van microdialysis worden beschreven samen met de uitgebreide toepassing door het combineren van andere methoden in vivo .
Introduction
ISF bestaat uit 15-20% van de totale hersenvolume en biedt een communicatie cruciaal voor signaaltransductie, substraat vervoer en afval goedkeuring1. Daarom zullen de mogelijkheid van het ISF verzamelen van levende dieren verlenen meer gevolgen voor verschillende biologische processen, alsmede ziekte mechanisme. In vivo microdialysis is een van de enkele methoden die steekproef en kwantificeren van extracellulaire moleculen van ISF van wakker, vrij bewegende dieren en daardoor fungeert als een nuttig hulpmiddel in neurowetenschap onderzoek veld2,3. Bij deze methode, microdialysis sondes met semipermeable membranen zijn ingevoegd in de hersenen en geperfundeerd met perfusie buffer op de relatief trage stroomsnelheid (0.1-5 µL/min). Tijdens deze perfusie, extracellulaire moleculen in ISF passief diffuse in de sonde volgens het verloop van de concentratie en verzamelen als een dialysate. Hoewel dit artikel richt zich op de methode om te monster ISF in de hersenen, kunnen zowel het beginsel als de methode worden toegepast op andere organen door de juiste wijziging indien nodig.
Microdialysis werkte eerst in de vroege jaren 1960, en sinds dan het uitgebreid gebruikt is voor het verzamelen van kleine molecules, zoals aminozuren of neurotransmitters in de hersenen. Echter, recente commerciële beschikbaarheid van microdialysis sondes met hoog-moleculair gewicht afgesneden membranen (100 kDa-3 MDa) heeft uitgebreid de toepassing ervan op relatief grotere proteïnen in ISF evenals4,5,6 ,7. De studies met behulp van deze sondes heeft geleid tot de bevinding dat eiwitten zoals tau of α-synuclein die werden lang beschouwd als exclusieve cytoplasmatische zijn ook fysiologisch aanwezig in ISF4,5,8.
Een van de problemen microdialysis sondes met grote afgesneden membranen (meestal meer dan 1.000 kDa) is dat ze gevoeliger voor ultrafiltratie vocht verlies als gevolg van de innerlijke druk opgebouwd in de sondes. Microdialysis sondes gebruikt hier hebben een unieke structuur om te voorkomen dat dit probleem. De druk zal niet worden opgebouwd als gevolg van deze structuur, dus microdialysis met deze sondes moet worden beheerd in een modus van de “push-pull” een spuitpomp met perfuse de sondes (= druk) en een roller/peristaltische pomp voor het verzamelen van de dialysate komen uit het stopcontact sonde (= Trek) 9 (hoewel het zowel push- en pull-pompen, als gevolg van druk annuleren luchtgaten aanwezig in de sondes, moet het systeem is technisch alleen aangestuurd door de pull-pomp). Dit artikel begint met de stereotaxic operatie een gids canule innesteling en wordt beschreven hoe u microdialysis regels instellen om te verzamelen van ISF via microdialysis sondes met 1.000 kDa cut-off membranen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdialysis met ultrahoog moleculair gewicht afgesneden membranen moet worden bediend door een push-pull-modus, dus is het essentieel dat het debiet nauwkeurig en constant is. De onnauwkeurigheid in de stroomsnelheid kunnen de oorzaak van air bubble generatie en inconsistentie in de concentratie van het monster. Als de stroom niet consistent is, controleert u alle verbindingen op lekkage. Als het probleem nog steeds aanhoudt, is het mogelijk dat het nodig om opnieuw te beginnen met nieuwe sondes en tubings.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door ” Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek op innovatieve gebieden (hersenen eiwitten veroudering en dementie Control)(15H01552) van MEXT en Grant-in-Aid voor jonge wetenschappers (B) (16K 20969). De auteur dankt Dr. David M. Holtzman en Dr. John R. Cirrito voor de technische adviezen tijdens de ontwikkeling van deze methode.
Materials
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
- Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
- Kushikata, T., Hirota, K. Neuropeptide microdialysis in free-moving animals. Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
- Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
- Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13 (2013).
- Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
- Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer’s disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
- Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
- Kang, J. -. E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
- Cirrito, J. R., et al. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo. Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).
- Bero, A. W., et al. Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition. Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).
- Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
- Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity. EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).
- Castellano, J. M., et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance. Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57 (2011).
- Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55 (2015).
- Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).
