אין ויוו Microdialysis שיטת איסוף גדול חלבונים חוץ-תאית נוזל בין-תאי המוח עם משקל מולקולרי גבוה ניתוק רגשים
Summary
Microdialysis in vivo אפשרה אוסף של מולקולות נוכח נוזל בין-תאי המוח (הקרן) מבעלי ער, להתנהג בחופשיות. על מנת לנתח מולקולות גדולות יחסית של הקרן הלאומית למדע, המאמר הנוכחי מתמקד במיוחד בפרוטוקול microdialysis באמצעות רגשים עם משקל מולקולרי גבוה לחתוך את הממברנות.
Abstract
In vivo microdialysis היא טכניקה חזקה כדי לאסוף את הקרן מבעלי ער, מתנהג באופן חופשי המבוסס על עיקרון דיאליזה. בעוד microdialysis היא שיטה ותיקה המודד מולקולות קטנות יחסית, כולל חומצות אמינו או נוירוטרנסמיטורים, לאחרונה שהשתמשו בה להעריך גם את הדינמיקה של מולקולות גדולות יותר של הקרן באמצעות רגשים עם משקל מולקולרי גבוה לחתוך ממברנות. בעת שימוש כזה הגששים, microdialysis יש לפעול במצב שכיבות למשוך כדי למנוע לחץ שהצטברו בתוך הגששים. מאמר זה מספק צעד אחר צעד פרוטוקולים כולל ניתוח stereotaxic וכיצד להגדיר קווים microdialysis לאסוף חלבונים מן הקרן. במהלך microdialysis, סמים יכול להינתן או מערכתית או על ידי אינפוזיה ישירה לתוך הקרן. Microdialysis הפוכה היא טכניקה להחדיר ישירות תרכובות לתוך הקרן. הכללת תרופות במאגר זלוף microdialysis מאפשר להם מפוזרת לתוך הקרן באמצעות הגששים תוך איסוף בו זמנית הקרן. על ידי מדידת חלבון טאו כדוגמה, המחבר מציג כמה רמות שלה השתנו בעת פעילות. עצבית מגרה על-ידי microdialysis ההפוך של picrotoxin. היתרונות והמגבלות של microdialysis מתוארים יחד עם הבקשה המורחבת על ידי שילוב של שיטות אחרות ויוו .
Introduction
הקרן כוללת 15-20% נפח המוח הכולל, מציע microenvironment קריטי עבור אותות, ולהזמנת המצע פסולת סיווג1. לכן, היכולת של איסוף הקרן מבעלי חיים יספקו יותר השלכות על תהליכים ביולוגיים שונים, כמו גם מנגנון המחלה. Microdialysis in vivo הוא אחד מהשיטות הדגימה לכמת חוץ-תאי המולקולות של הקרן מ ער, בחופשיות חיות ו ובכך משמשת כלי שימושי2,בשדה מחקר מדעי המוח3. בשיטה זו, microdialysis הגששים עם ממברנות semipermeable מוכנס במוח, perfused עם מאגר זלוף קצב זרימה איטית יחסית (0.1-5 µL/min). במהלך זה זלוף, חוץ-תאי המולקולות של הקרן פסיבי לפזר לתוך המכשיר על פי מעבר הצבע ריכוז ולאסוף כמו dialysate. למרות מאמר זה מתמקד בשיטת מדגם הקרן במוח, העיקרון והן השיטה ניתן להחיל לאיברים אחרים על-ידי שינוי המתאים במידת הצורך.
Microdialysis הועסק לראשונה בשנות ה-60 המוקדמות, ומאז ואז היא בשימוש נרחב כדי לאסוף את מולקולות קטנות כולל חומצות אמינו או עצביים במוח. עם זאת, לאחרונה הזמינות המסחרית של הגששים microdialysis עם משקל גבוה-מולקולרי לחתוך ממברנות (kDa-3 100 מד א) האריך היישום שלה יחסית גדול יותר חלבונים ב- ISF כמו גם4,5,6 ,7. המחקרים באמצעות רגשים אלו הוביל הממצא הזה חלבונים כגון טאו או α-synuclein זה זמן נחשבו בלעדי cytoplasmic נוכחות גם הן מבחינה פיזיולוגית ב- ISF-4,–5,–8.
אחד הקשיים בעזרת microdialysis הגששים גדול לחתוך ממברנות (בדרך כלל מעל 1,000 kDa) היא כי הם רגישים יותר אולטראפילטרציה אובדן נוזלים עקב הלחץ הפנימי שמצטבר את הגששים. הגששים Microdialysis המשמש כאן יש מבנה ייחודי כדי להימנע מבעיה זו. הלחץ לא יבנה בשל מבנה זה, ובכך microdialysis עם הגששים אלה צריך להיות מופעל במצב “push-pull” באמצעות מזרק משאבה כדי perfuse את הגששים (= דחיפה), משאבה סחרור/רולר כדי לאסוף את מגיע dialysate מהשפך בדיקה (= משיכה) 9 (למרות שצריך לדחוף ולמשוך משאבות, בעקבות לחץ ביטול חורים פתח ב הגששים, המערכת טכנית רק מונעת על ידי משיכה המשאבה). מאמר זה מתחיל עם הניתוח stereotaxic של השרשה בצינורית מדריך, מאמר זה מתאר כיצד להגדיר קווים microdialysis כדי לאסוף הקרן באמצעות microdialysis הגששים עם 1,000 kDa ניתוק ממברנות.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdialysis עם משקל מולקולרי גבוה לחתוך ממברנות להפעלה על-ידי מצב מו-דו, וכך זה קריטי כי קצב הזרימה הוא מדויק וקבוע. אי-הדיוק את שיעורי זרימת יכול להיות הגורם של דור בועות אוויר, חוסר עקביות הריכוז לדוגמה. אם הזרם הוא לא עקבי, בדוק את כל חיבורי עבור דליפה. אם הבעיה עדיין נמשכת, ייתכן צורך להתחיל מח…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי ‘ מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (חלבון להזדקנות המוח, דמנציה Control)(15H01552) MEXT, מענק הסיוע עבור צעירים מדענים (B) (16K 20969). המחבר תודה ד ר דוד מ הולצמן, ד ר ג’ון ר’ Cirrito על עצות טכניות במהלך הפיתוח של שיטה זו.
Materials
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
- Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
- Kushikata, T., Hirota, K. Neuropeptide microdialysis in free-moving animals. Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
- Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
- Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13 (2013).
- Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
- Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer’s disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
- Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
- Kang, J. -. E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
- Cirrito, J. R., et al. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo. Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).
- Bero, A. W., et al. Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition. Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).
- Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
- Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity. EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).
- Castellano, J. M., et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance. Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57 (2011).
- Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55 (2015).
- Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).
