Vivo Microdialysis beyin interstisyel sıvı yüksek moleküler ağırlık kesme ile gelen büyük hücre dışı proteinler toplamak için yöntem probları
Summary
Vivo microdialysis molekülleri uyanık, özgürce davranmaya hayvanlardan beyin interstisyel sıvı (ISF) mevcut topluluğu sağlamıştır. ISF nispeten büyük molekülleri çözümlemek amacıyla geçerli madde özellikle probları yüksek molekül ağırlıklı membranlar kesim ile microdialysis iletişim kuralı’nı odaklanır.
Abstract
Vivo microdialysis bir diyaliz ilkesine dayanarak uyanık, özgürce davranmaya hayvanlardan ISF toplamak için güçlü bir tekniktir. Microdialysis amino asitler veya nörotransmiterler gibi nispeten küçük moleküller ölçer kurulan bir yöntem olmakla birlikte, bu son zamanlarda da büyük moleküllerin probları yüksek molekül ağırlıklı kesilmiş ile kullanarak ISF dinamikleri değerlendirmek için kullanılmıştır membranlar. Bu tür sondalar kullanarak üzerine microdialysis sondalar içinde birikmiş basınç önlemek için bir itme-çekme modunda çalışmak zorundadır. Bu makalede stereotaksik cerrahi ve proteinler ISF toplamak için microdialysis satırlarını ayarlamak nasıl da dahil olmak üzere adım adım iletişim kurallarını sağlar. Microdialysis sırasında ilaçların sistemik veya ISF içine doğrudan infüzyon tarafından yönetilebilir. Ters microdialysis doğrudan bileşikler ISF demlemek için bir tekniktir. Uyuşturucu microdialysis perfüzyon arabellekte eklenmesi ISF sonda aynı anda ISF toplarken diffüz almalarını sağlar. Tau protein örnek olarak ölçerek, yazar nasıl kendi düzeyleri uyarıcı nöronal aktivite picrotoxin ters microdialysis tarafından değiştirilmiş gösterir. Avantajları ve microdialysis sınırlamaları genişletilmiş uygulama ile birlikte diğer vivo içinde yöntemleri birleştirerek anlatılmaktadır.
Introduction
ISF toplam beyin hacmi 15-%20 oluşur ve sinyal iletimi, substrat taşıma ve atık temizleme1için kritik bir microenvironment sunmaktadır. Bu nedenle, yaşayan hayvanlardan ISF toplama yeteneği büyük etkileri çeşitli biyolojik süreçlerin yanı sıra hastalığı mekanizması için sağlayacaktır. İn vivo microdialysis birkaç yöntemden birini bu örnek ve serbestçe hareket hayvan hücre dışı molekülleri ISF üzerinden gelen uyanık, ölçmek ve böylece nörolojik araştırma alanı2,3yararlı bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu yöntemde, microdialysis sonda semipermeable Membranlar ile beyinde eklenen ve perfüzyon arabelleği nispeten yavaş akış oranı ile periosteum (0,1-5 µL/dak). Bu perfüzyon sırasında ISF ekstraselüler molekülleri pasif konsantrasyon gradyanı göre soruşturma içine diffüz ve diyalizat toplamak. Bu makale örnek ISF beyinde yöntemine üzerinde duruluyor olsa da, ilke ve yöntemi diğer organlara uygun değişikliğe göre gerekirse uygulanabilir.
O zaman yoğun amino asitler veya nörotransmitter beyinde de dahil olmak üzere küçük moleküller toplamak için kullanılan Microdialysis 1960’ların ve beri ilk istihdam edildi. Ancak, microdialysis probları yüksek moleküler ağırlığı membranlar (100 kDa-3 MDa) kesme son ticari durumu4,5,6 yanı sıra ISF nispeten daha büyük proteinler için uygulama genişletti ,7. Bu sonda kullanarak çalışmaları için bulma açmıştır bu proteinler tau veya α-synuclein gibi uzun olması düşünülen özel sitoplazmik Ayrıca ISF4,5,8‘ fizyolojik olarak mevcut.
Membranlar (genellikle üzerinde 1.000 kDa) büyük kesik ile microdialysis sonda kullanarak zorluklar Ultrafiltrasyon sıvı kaybı sondalar içinde birikmiş basınç nedeniyle daha duyarlı oldukları biridir. Burada kullanılan Microdialysis sondalar bu sorunu önlemek için benzersiz bir yapıya sahip. Böylece bu sonda ile microdialysis (= Itme) prob ve diyalizat geliyor sonda prizinden toplamak için bir silindir/peristaltik pompa sıvı için bir şırınga pompa kullanarak bir “itme-çekme” modunda ameliyat, basınç bu yapısı sayesinde yerleşik değil (= çekme) 9 (her ne kadar itme ve çekme pompalar, havalandırma delikleri sonda, mevcut iptal baskısı yüzünden ihtiyacı sistem teknik olarak sadece çekme pompası tarafından tahrik edilmektedir). Bu makale kılavuzu kanül implantasyon stereotaksik cerrahi ile başlar ve ISF microdialysis probları ile 1.000 kDa kesme membranlar yoluyla toplamak için microdialysis satırlarını ayarlamak nasıl açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdialysis yüksek molekül ağırlıklı membranlar kesim ile bir itme-çekme modu tarafından ameliyat olmak zorunda, böylece akış hızı doğru ve sürekli önemlidir. Yanlışlık içinde akış oranları hava kabarcık üretimi ve örnek konsantrasyon tutarsızlığına neden olabilir. Akış tutarsız ise, sızıntı için tüm bağlantılarını kontrol edin. Sorun hala devam ederse, yeni probları ve Bacalar ile yeniden başlatmak gerekli olabilir.
Microdilaysis sondalar sürekli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser tarafından desteklenen ” Grant-in-Aid bilimsel araştırma yenilikçi alanlarda (Beyin Protein eskime ve demans Control)(15H01552) MEXT ve Grant-in-Aid için genç bilim adamları (B) (16K 20969). Yazar Dr David M. Holtzman ve Dr. John R. Cirrito bu yöntem geliştirme sırasında teknik tavsiye için teşekkürler.
Materials
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
- Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
- Kushikata, T., Hirota, K. Neuropeptide microdialysis in free-moving animals. Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
- Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
- Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13 (2013).
- Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
- Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer’s disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
- Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
- Kang, J. -. E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
- Cirrito, J. R., et al. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo. Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).
- Bero, A. W., et al. Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition. Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).
- Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
- Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity. EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).
- Castellano, J. M., et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance. Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57 (2011).
- Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55 (2015).
- Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).
