En Vivo Sondas de microdiálisis método para recolectar grandes proteínas extracelulares de líquido intersticial cerebral con corte de peso molecular alto
Summary
Microdiálisis in vivo ha permitido colección de moléculas presentes en el líquido intersticial del cerebro (ISF) de animales despiertos, comportarse libremente. Con el fin de analizar las moléculas relativamente grandes en ISF, el actual artículo se centra específicamente en el protocolo de microdialysis con sondas de alto peso molecular cortado de las membranas.
Abstract
Microdiálisis in vivo es una técnica poderosa para recoger ISF en despiertos, comportándose libremente animales basados en el principio de la diálisis. Aunque la microdiálisis es un método establecido que mide relativamente pequeñas moléculas como aminoácidos o neurotransmisores, se ha utilizado recientemente para evaluar también la dinámica de moléculas más grandes en ISF usando puntas de prueba con alto peso molecular cortado membranas. Al uso de estas sondas, microdialysis tiene que ejecutar en modo push-pull para evitar la presión acumulada dentro de las sondas. Este artículo proporciona protocolos paso a paso, incluyendo cirugía estereotáctica y cómo configurar líneas de microdiálisis para recoger las proteínas de la ISF. Durante microdialysis, drogas pueden administrarse ya sea sistémica o por infusión directa en ISF. Microdiálisis reversa es una técnica para incorporar directamente compuestos en ISF. Inclusión de medicamentos en el búfer de perfusión de microdiálisis permite que difunden en ISF a través de las sondas mientras recogía simultáneamente ISF. Mediante la medición de la proteína tau por ejemplo, el autor muestra cómo los niveles se alteran al estimular la actividad neuronal por microdiálisis reversa de picrotoxin. Ventajas y limitaciones de microdiálisis se describen junto con la solicitud extendida mediante la combinación de otros métodos en vivo .
Introduction
ISF consta de 15-20% del volumen total del cerebro y ofrece un microentorno crítico para la transducción de señales, transporte de substrato y separación de residuos1. Por lo tanto, la capacidad de recogida de ISF de animales vivos proporcionará mayor implicaciones para diversos procesos biológicos como mecanismo de enfermedad. Microdiálisis in vivo es uno de los pocos métodos muestra y cuantificar moléculas extracelulares de ISF de despierto, moviendo libremente animales y de tal modo sirve como una herramienta útil en Neurociencias investigación campo2,3. En este método, las sondas de microdiálisis con membranas semipermeables son insertadas en el cerebro y perfundidas con tampón de perfusión en la tasa de flujo relativamente lento (0.1-5 μl/min). Durante esta perfusión, moléculas extracelulares en ISF pasivamente se difunden en la punta de prueba según el gradiente de concentración y recogen como un dializado. Aunque este artículo se centra en el método de muestra de ISF en el cerebro, el principio y el método pueden aplicarse a otros órganos por la modificación apropiada si es necesario.
Microdiálisis primero fue empleado en la década de 1960 y desde entonces ha sido ampliamente utilizado para recoger pequeñas moléculas como aminoácidos o neurotransmisores en el cerebro. Sin embargo, la reciente disponibilidad comercial de las sondas de microdiálisis con peso molecular alto cortar membranas (100 kDa 3 MDa) ha extendido su aplicación a las proteínas relativamente mayores en ISF así4,5,6 ,7. Los estudios de uso de estas sondas ha llevado a la conclusión que las proteínas como tau o α-sinucleína que durante mucho tiempo se pensó que exclusiva citoplásmico también son fisiológicamente presente en ISF4,5,8.
Una de las dificultades con sondas de microdiálisis de corte grandes membranas (normalmente más de 1.000 kDa) es que son más susceptibles a la pérdida de líquido de ultrafiltración debido a la presión interna acumulada en las puntas de prueba. Sondas de microdiálisis aquí tienen una estructura única para evitar este problema. La presión no se construirá debido a esta estructura, por lo tanto microdialysis con estas puntas de prueba debe ser operado en un modo de “push-pull” utilizando una bomba de jeringa para inundar las sondas (= empuje) y una bomba peristáltica/rodillo para recoger la venida del dializado de la salida de la sonda (= tirar) 9 (aunque necesita empujar y tirar bombas, debido a la cancelación de los orificios de ventilación en las puntas de prueba, la presión el sistema es técnicamente sólo impulsado por la bomba de extracción). Este artículo comienza con la cirugía estereotáctica de una implantación de cánula guía y describe cómo configurar líneas de microdiálisis para recoger ISF a través de sondas de microdiálisis con 1.000 membranas de corte kDa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microdialysis con alto peso molecular cortado las membranas tiene que ser operado por un modo de vaivén, por lo tanto es fundamental que el caudal es constante y precisa. La inexactitud en las tasas de flujo puede ser la causa de la generación de burbujas de aire y la inconsistencia en la concentración de la muestra. Si el flujo es incompatible, verifique todas las conexiones de salida. Si el problema persiste, puede ser necesario volver a empezar con nuevas sondas y tubos.
Sondas Microdila…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por ” subvenciones para la investigación científica en áreas innovadoras (proteína cerebral envejecimiento y demencia Control)(15H01552) de MEXT y subvenciones para jóvenes científicos (B) (16K 20969). El autor agradece a Dr. David M. Holtzman y Dr. John R. Cirrito para el asesoramiento técnico durante el desarrollo de este método.
Materials
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
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