वीवो में Microdialysis विधि उच्च आणविक वजन कट ऑफ जांच के साथ मस्तिष्क मध्य द्रव से बड़े Extracellular प्रोटीन इकट्ठा करने के लिए
Summary
vivo microdialysis में जाग, स्वतंत्र रूप से व्यवहार जानवरों से मस्तिष्क मध्यवर्ती द्रव (ISF) में मौजूद अणुओं का संग्रह सक्षम है । आदेश में ISF में अपेक्षाकृत बड़े अणुओं का विश्लेषण करने के लिए, वर्तमान लेख विशेष रूप से microdialysis उच्च आणविक वजन काट झिल्ली के साथ जांच का उपयोग प्रोटोकॉल पर केंद्रित है ।
Abstract
विवो microdialysis में एक डायलिसिस सिद्धांत पर आधारित जागर, स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले जानवरों से ISF इकट्ठा करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है । जबकि microdialysis एक स्थापित विधि है कि अमीनो एसिड या न्यूरोट्रांसमीटर सहित अपेक्षाकृत छोटे अणुओं के उपाय है, यह हाल ही में भी उच्च आणविक वजन कट के साथ जांच का उपयोग कर ISF में बड़े अणुओं की गतिशीलता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है झिल्ली. इस तरह की जांच का उपयोग करने पर, microdialysis जांच के अंदर संचित दबाव से बचने के लिए एक पुश-पुल मोड में चलाया जा करने के लिए है । यह लेख stereotaxic सर्जरी सहित चरण दर चरण प्रोटोकॉल प्रदान करता है और कैसे ISF से प्रोटीन इकट्ठा करने के लिए microdialysis लाइनों स्थापित करने के लिए । microdialysis के दौरान, दवाओं या तो प्रणालीबद्ध या ISF में प्रत्यक्ष अर्क द्वारा प्रशासित किया जा सकता है । रिवर्स microdialysis सीधे ISF में यौगिकों को भ्रमित करने के लिए एक तकनीक है । microdialysis छिड़काव बफर में दवाओं का समावेश उंहें जांच के माध्यम से ISF में फैलाना है, जबकि एक साथ ISF इकट्ठा करने की अनुमति देता है । एक उदाहरण के रूप में ताऊ प्रोटीन को मापने के द्वारा, लेखक दिखाता है कि कैसे अपने स्तर picrotoxin के रिवर्स microdialysis द्वारा ंयूरॉंस गतिविधि उत्तेजक पर बदल रहे हैं । लाभ और microdialysis की सीमाएं vivo तरीकों में अंय संयोजन द्वारा विस्तारित आवेदन के साथ वर्णित हैं ।
Introduction
ISF कुल मस्तिष्क की मात्रा का 15-20% शामिल है और संकेत transduction, सब्सट्रेट परिवहन और अपशिष्ट निकासी1के लिए महत्वपूर्ण microenvironment प्रदान करता है । इसलिए, पशुओं के रहने से ISF इकट्ठा करने की क्षमता विभिंन जैविक प्रक्रियाओं के लिए अधिक से अधिक निहितार्थ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से रोग तंत्र प्रदान करेगा । vivo microdialysis में कुछ तरीकों में से एक है कि नमूना और जाग से ISF से extracellular अणुओं यों तो, स्वतंत्र रूप से पशुओं को ले जाने और इस तरह तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान क्षेत्र2,3में एक उपयोगी उपकरण के रूप में कार्य करता है । इस विधि में, semipermeable झिल्ली के साथ microdialysis जांच मस्तिष्क में डाला जाता है और अपेक्षाकृत धीमी प्रवाह दर पर छिड़काव बफर के साथ perfused (0.1-5 µ l/ इस छिड़काव के दौरान, ISF में extracellular अणुओं निष्क्रिय एकाग्रता ढाल के अनुसार जांच में फैलाना और एक अपोहित के रूप में इकट्ठा । हालांकि यह लेख मस्तिष्क में ISF नमूना करने के लिए विधि पर केंद्रित है, दोनों सिद्धांत और विधि यदि आवश्यक हो तो उचित संशोधन के द्वारा अन्य अंगों के लिए लागू किया जा सकता है ।
Microdialysis पहले 1960 के दशक में कार्यरत था, और तब से यह बड़े पैमाने पर किया गया है एमिनो एसिड या न्यूरोट्रांसमीटर मस्तिष्क में सहित छोटे अणुओं को इकट्ठा करने के लिए. हालांकि, उच्च आणविक वजन कट ऑफ झिल्ली (१०० केडीए-3 एमडीए) के साथ microdialysis जांच की हाल ही में वाणिज्यिक उपलब्धता के रूप में अच्छी तरह से ISF में अपेक्षाकृत बड़ा प्रोटीन के लिए अपने आवेदन बढ़ाया है4,5,6 ,7. इन जांचों का उपयोग कर अध्ययन खोज करने के लिए नेतृत्व किया है कि ऐसे ताऊ या α-synuclein कि लंबे समय के लिए अनंय cytoplasmic होने के लिए सोचा था के रूप में प्रोटीन भी शारीरिक ISF4,5,8में मौजूद हैं ।
एक बड़ी (आमतौर पर १,००० केडीए से अधिक कट) झिल्ली के साथ microdialysis जांच का उपयोग कठिनाइयों का है कि वे और अधिक ultrafiltration द्रव जांच में संचित दबाव के कारण नुकसान के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । Microdialysis जांच यहां इस्तेमाल एक अद्वितीय संरचना इस मुद्दे से बचने के लिए है । दबाव इस संरचना के कारण नहीं बनाया जाएगा, इस प्रकार इन जांचों के साथ microdialysis एक “पुश में संचालित किया जाना चाहिए पुल” एक सिरिंज पंप का उपयोग करने के लिए जांच perfuse (पुश =) और एक रोलर/सिकुड़नेवाला पंप जांच आउटलेट से आ रही अपोहित इकट्ठा करने के लिए (= खींचो) 9 (हालांकि यह दोनों धक्का और पुल पंपों की जरूरत है, जांच में मौजूद वेंट छेद रद्द दबाव के कारण, प्रणाली तकनीकी रूप से केवल पुल पंप द्वारा संचालित है) । यह लेख एक गाइड प्रवेशनी आरोपण के stereotaxic सर्जरी के साथ शुरू होता है और १,००० केडीए कट-ऑफ झिल्ली के साथ microdialysis जांच के माध्यम से ISF इकट्ठा करने के क्रम में microdialysis लाइनों स्थापित करने के लिए कैसे का वर्णन करता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
उच्च आणविक वजन कट बंद झिल्ली के साथ Microdialysis एक पुश-पुल मोड द्वारा संचालित किया जाना है, इस प्रकार यह महत्वपूर्ण है कि प्रवाह की दर सही है और लगातार है । प्रवाह दरों में अशुद्धि हवा बुलबुला पीढ़ी और नमूना एक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के द्वारा समर्थित किया गया था ‘ ‘ अनुदान में अभिनव क्षेत्रों पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता (मस्तिष्क प्रोटीन एजिंग और मनोभ्रंश नियंत्रण) (15H01552) से MEXT और अनुदान में सहायता के लिए युवा वैज्ञानिकों (ख) (16K20969). लेखक धंयवाद डॉ डेविड एम Holtzman और डॉ जॉन आर Cirrito इस पद्धति के विकास के दौरान तकनीकी सलाह के लिए ।
Materials
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
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