In Vivo Mikrodialys metod att samla stora extracellulära proteiner från hjärnan interstitiell vätska med High-molecular vikt Cut-off sonder
Summary
In vivo mikrodialys har aktiverat insamling av molekyler som finns i hjärnan interstitiell vätska (ISF) från vaken, fritt-beter sig djur. För att kunna analysera relativt stora molekyler i ISF, fokuserar den nuvarande artikeln specifikt på protokollet mikrodialys med sonder med hög molekylvikt avskurna membran.
Abstract
In vivo mikrodialys är en kraftfull teknik för att samla in ISF från vaken, fritt-beter sig djur baserat på en princip som dialys. Mikrodialys är en etablerad metod som mäter relativt små molekyler inklusive aminosyror eller signalsubstanser, har det använts nyligen att också bedöma dynamiken i större molekyler i ISF med sonder med hög molekylvikt avskurna membran. När du använder sådana sonder, måste mikrodialys köras i en push-pull-läge för att undvika tryck ackumuleras inuti sonderna. Den här artikeln innehåller stegvisa protokoll inklusive stereotaxic kirurgi och hur du ställer in mikrodialys linjer att samla proteiner från ISF. Under mikrodialys, kan droger administreras antingen systemiskt eller genom direkt infusion i ISF. Omvänd mikrodialys är en teknik att direkt ingjuta föreningar i ISF. Införandet av droger i mikrodialys perfusion bufferten tillåter dem att diffunderar in ISF genom sonderna medan samtidigt samla ISF. Genom att mäta tau-protein som exempel, visar författaren hur dess nivåer ändras vid stimulerande neuronal aktivitet med omvänd mikrodialys av picrotoxin. Fördelar och begränsningar av mikrodialys beskrivs tillsammans med ansökan om utökad genom att kombinera andra in-vivo -metoder.
Introduction
ISF består av 15-20% av total hjärnvolym och erbjuder en kritisk för signaltransduktion, substrat transport och avfall clearance1mikromiljö. Därför får förmågan att samla ISF från levande djur större konsekvenser för olika biologiska processer samt sjukdom mekanism. In vivo mikrodialys är en av de få metoderna som prov och kvantifiera extracellulära molekyler från ISF från vaken, fritt rörliga djur och fungerar därmed som ett användbart verktyg i neurovetenskap forskning fält2,3. I denna metod, mikrodialys sonder med semipermeable membraner infogas i hjärnan och perfusion med perfusion buffert på relativt långsamma flödet klassar (0.1-5 µL/min). Under denna perfusion, extracellulära molekyler i ISF passivt diffunderar in sonden enligt koncentrationsgradient och samla som en dialysatet. Även om denna artikel fokuserar på metoden att provet ISF i hjärnan, kan både principen och metoden tillämpas till andra organ genom lämpliga ändringar om det behövs.
Mikrodialys var först anställd i 1960-talet, och sedan då det har använts i stor utsträckning att samla små molekyler inklusive aminosyror eller signalsubstanser i hjärnan. Dock har nyligen kommersiella tillgången av mikrodialys sonder med högmolekylära vikt avskurna membran (100 kDa-3 MDa) utökat sin ansökan till relativt större proteiner i ISF samt4,5,6 ,7. De studier som använder dessa sonder lett till konstaterandet att proteiner såsom tau eller α-synuclein som troddes länge vara exklusiv cytoplasmiska förekommer även fysiologiskt på ISF4,5,8.
En av svårigheterna med mikrodialys sonder med stora avskurna membran (typiskt över 1.000 kDa) är att de är mer mottagliga för ultrafiltrering vätskeförlust på grund av det inre trycket som ackumulerats i sonderna. Mikrodialys sonder används här har en unik struktur för att undvika det här problemet. Trycket kommer inte att byggas på grund av denna struktur, således mikrodialys med dessa sonder bör bedrivas i en ”push-pull”-läge med en sprutpump för att BEGJUTA sonderna (= push) och en rulle/peristaltiska pumpen att samla dialysatet ankomst från sonden utlopp (= pull) 9 (även om den behöver både push- och pull pumpar, på grund av trycket cancelling ventilationshål i sonderna, systemet tekniskt endast drivs av dra pumpen). Denna artikel börjar med stereotaxic kirurgin av en guide kanyl implantation och beskriver hur du ställer in mikrodialys linjer för att samla in ISF genom mikrodialys sonder med 1.000 kDa cut-off membran.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrodialys med hög molekylvikt avskurna membran har att drivas av en push-pull-läge, därför är det viktigt att flödet är korrekta och konstant. Felaktigheten i det flöde klassar kan vara orsaken till luft bubbla generation och inkonsekvens i provet koncentrationen. Om flödet är inkonsekvent, kontrollera alla anslutningar för läckage. Om problemet fortfarande kvarstår, kan det vara nödvändigt att starta om med nya sonder och sladdarna.
Microdilaysis sonder är kontinuerligt perf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av ” bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden (Brain Protein åldrande och demens Control)(15H01552) från MEXT och bidrag för unga forskare (B) (16K 20969). Författaren tack Dr. David M. Holtzman och Dr John R. Cirrito för tekniska råd under utvecklingen av denna metod.
Materials
| The Univentor 820 Microsampler | Univentor | 8303002 | Refrigerated fraction collector |
| Syringe pump | KD scientific | KDS-101 | |
| Roller pump | Eicom microdialysis | ERP-10 | |
| Raturn Stand-Alone System | BASi | MD-1409 | Free-moving system |
| Dual species cage kit | BASi | CX-1600 | |
| AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm) | Eicom microdialysis | PEP-8-02 | Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical. |
| Microdialysis guide (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PEG-8 | |
| Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PED-8 | |
| Bone screw | BASi | MD-1310 | |
| Super bond C&B set | Sunmedical | Dental cement | |
| Small animal Stereotaxic Instrument with digital display console | Kopf | Model 940 | Stereotaxic apparatus |
| Mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse Stereotaxic | Stoelting | 51648 | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A7284-50ML | 30% BSA solution |
| FEP tubing (70 cm) | Eicom microdialysis | JF-10-70 | Internal volume = 0.5 µL/cm |
| Teflon tubing (50 cm) | Eicom microdialysis | JT-10-50 | Internal volume = 0.08 µL/cm |
| Byton tube | Eicom microdialysis | JB-30 | |
| Intramedic luer stab adaptor 23G | BD | 427565 | Blunt end needle |
| Roller tube | Eicom microdialysis | RT-5S | Internal volume = 4 µL |
| Cap nut | Eicom microdialysis | AC-5 | |
| 0.25 mL microcentrifuge tube with cap | QSP | 503-Q | Tubes for fraction collector |
| Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm) | Eicom microdialysis | PESG-8 | |
| Connection needle | Eicom microdialysis | RTJ | |
| Mouse animal collar | BASi | MD-1365 | |
| High Speed Rotary Micromotor kit | FOREDOM | K.1070 | Drill |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| Screw driver for bone screws | |||
| Scalpel | |||
| Cotton swab | |||
| Surgical clipper |
References
- Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
- Kushikata, T., Hirota, K. Neuropeptide microdialysis in free-moving animals. Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
- Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
- Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13 (2013).
- Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
- Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer’s disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
- Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
- Kang, J. -. E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
- Cirrito, J. R., et al. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo. Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).
- Bero, A. W., et al. Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition. Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).
- Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
- Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity. EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).
- Castellano, J. M., et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance. Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57 (2011).
- Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55 (2015).
- Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).
