Generasjon og behovsbetinget initiering av akutt Ictal aktivitet i gnagere og menneskelig vev
Summary
Akutt anfall modeller er viktig for å studere mekanismer underliggende epileptiform hendelser. I tillegg gir muligheten til å generere epileptiform hendelser på forespørsel en svært effektiv metode for å studere den nøyaktige sekvensen av hendelser underliggende deres innvielse. Her beskriver vi akutt 4-aminopyridine kortikale anfall modeller etablert i musen og menneskelig vev.
Abstract
Kontrollere beslag er et utfordrende problem for det medisinske fellesskapet. For å gjøre fremgang, trenger forskere en måte å mye studere anfall dynamics og undersøke de underliggende mekanismene. Akutt anfall modeller er praktisk, tilbyr muligheten til å utføre elektrofysiologiske innspillinger og kan generere store mengder electrographic beslag som (ictal) hendelser. Lovende funn fra akutt anfall modeller kan deretter være avansert kronisk epilepsi modeller og kliniske studier. Dermed vil studere beslag i akutt modeller som trofast gjenskape electrographic og dynamiske signaturene i en klinisk anfall være avgjørende for å gjøre klinisk korrelasjon. Studere ictal hendelser i akutt anfall modeller utarbeidet av menneskelig vev er også viktig for å gjøre funnene som klinisk relevante. Sentralt i dette papiret er på kortikale 4-AP modellen på grunn av sin allsidighet generere ictal hendelser i både i vivo og vitro studier og både mus og menneskelig vev. Metodene i denne artikkelen vil også beskriver en alternativ metode for anfall induksjon med null-Mg2 + modellen og gi en detaljert oversikt over fordelene og begrensningene epileptiform-lignende aktivitet generert de forskjellige akutt anfall modeller. Videre ved å utnytte kommersielt tilgjengelig optogenetic musen stammer, kan en kort (30 ms) lys pulsen brukes til å utløse en ictal hendelse-identiske med de som oppstår spontant. Tilsvarende kan 30-100 ms puffs av nevrotransmittere (Gamma-Amino Butyric Acid eller glutamat) brukes til menneskelig vev å utløse ictal hendelser som er identiske med de som oppstår spontant. Muligheten til å utløse ictal hendelser på etterspørselen i akutt anfall modeller tilbyr nyvunne å observere den nøyaktige sekvensen av hendelser som ligger anfall innvielsen dynamics og effektivt vurdere potensielle anti-beslag terapier.
Introduction
Akutt anfall modeller kan kunne reprodusere electrographic signaturer minner ictal Hendelsesforløpet observert i EEG (EEG) av enkeltpersoner opplever et anfall. Forskere bruke disse ictal-lignende hendelser (heretter referert til som “ictal eventer”) som surrogater for anfall hendelse1. Klinisk tjene ictal hendelser som en pålitelig proxy for anfall hendelser siden beslag er en nevrologisk lidelse som stammer fra hjernen. I epilepsi overvåking enhet stole nevrologer på deteksjon av ictal hendelser å bekrefte hjernens epileptogenic regionen og isolere den resection2. I intensivavdelingen overvåker leger ictal aktivitet å vurdere om alle beslag aktivitet vedvarer i bedøvet pasienter3. Kontrollere beslag gjenstår for å bli et utfordrende problem for det medisinske fellesskapet, 30% av epilepsi pasienter er resistente til tilgjengelig medisiner4,5og 10% av medisinske saker som involverer narkotikainduserte beslag er ikke svarer til standard behandling3. Dette utgjør en alvorlig bekymring for samfunnet, som 10% av den amerikanske befolkningen er skjerpet for å oppleve en anfall hendelse i livet og 3% forventes å utvikle epilepsi6.
Studere beslag i kronisk epilepsi modeller er dyrt, arbeidskrevende, og ofte tar måneder å forberede7. Det er også vanskelig å utføre elektrofysiologiske opptak i fritt flytte dyr. Kliniske studier står overfor lignende problemer, i tillegg til ytterligere komplikasjoner relatert til pasienten samtykke, variasjon i deltakernes bakgrunner og moralske og etiske betraktninger involvert8. Akutt anfall modeller, derimot, er gunstig fordi de er relativt lett å forberede, kostnadseffektiv og generere store mengder ictal hendelser for studier9. I tillegg er vevet fast i en stabil posisjon, slik forholdene er ideelle for å utføre elektrofysiologiske opptakene nødvendig å studere anfall dynamics og beslektede underliggende patofysiologi. Akutt anfall modeller være gunstige forhold i sili (datamaskin) modeller fordi de er basert på biologisk materiale består av hjernens konstituerende nevrale nettverk med alle dens iboende faktorer og synaptic tilkobling, som ikke kan fanges selv de mest detaljerte datamaskinen modeller10. Disse funksjonene gjør akutt anfall modeller klar for å være effektiv til screening potensielle anti-beslag terapi og gjøre foreløpige funn før fremme dem for videre etterforskning i kronisk epilepsi modeller og kliniske studier.
Vanligvis utarbeides akutt anfall modeller fra normal hjernevev som har vært utsatt for hyper-nervøs forhold. For å indusere klinisk relevante ictal hendelser i sunn hjernevev, er det viktig å forstå at hjernen fungerer optimalt i en kritisk tilstand11 hvor eksitasjon (E) og hemming (I) er balansert12. Avbrudd av E-jeg balanse kan føre til hyper-nervøs anfall staten der ictal hendelser føre. Følgelig, i dette konseptuelle rammeverket, det er to viktige strategier for å generere ictal hendelser i hjernen skiver (i vitro) eller hele-hjerne (i vivo) forberedelser: redusert hemming (“disinhibition”) eller økt eksitasjon (“ikke-disinhibition”). Men ictal hendelser er svært organisert og synkronisert hendelser som krever påvirkning av GABAergic interneurons å organisere nettverk aktivitet13,14. Derfor er ikke-disinhibition modellene de mest effektive for genererer ictal hendelser i isolerte nevrale nettverk, som i en i vitro hjernen skjær15, mens i vitro disinhibition modeller ofte føre til skyter aktivitet minner om interictal som skyter. Videre i dette konseptuelle rammeverket, kan en kortvarig synkronisering hendelse også pålitelig utløse en ictal hendelse16. Faktisk kan en ictal hendelse utløses av noen mindre forstyrrelsene på neural systemet17 når det er i en kritisk tilstand overgang (“bifurkasjonen”) punkt18. Tradisjonelt har ble disse forstyrrelser indusert av elektrisk stimulering. Den siste utviklingen av optogenetics i nevrovitenskap, men tilbyr nå en mer elegant strategi for å indusere kritisk tilstand overganger16.
Metodene som er beskrevet i denne artikkelen viser hvordan du genererer ictal hendelser på forespørsel i akutt anfall modeller for både i vitro (trinn 1 av protokollen) og i vivo studier (trinn 2 av protokollen). De involverer valg av hjernen regionen, beslag induksjon metoden, studie type og arter; men vil fokus være på anbefalt valg av en akutt 4-AP kortikale anfall modell på grunn av sin allsidighet i en rekke typer studie. Akutt i vitro 4-AP anfall modellen er basert på standard protokoll forberede høykvalitets hjernen skiver elektrofysiologiske opptak og imaging studier19. Disse protokollene har allerede blitt brukt til å gjøre i vitro koronale hjernen sektorer fra somatosensory-motorisk cortex mus16,20 og mennesker21. Endringer til å generere ictal hendelser i disse typer hjernen skiver har vist tidligere16 og detaljer er beskrevet i protokollen nedenfor. Akutt i vivo 4-AP kortikale anfall modellen er basert på standard protokoll å forberede en craniotomy imaging studier22. Endringen er at ingen (objektglass) vindu er installert etter craniotomy. I stedet brukes topically proconvulsant agenter (4-AP) til utsatte cortex å indusere ictal hendelser mens dyret er under narkose. Vi vet var vår gruppe først til å utvikle denne akutt i vivo kortikale anfall modellen i mus16,23. Akutt i vivo 4-AP kortikale anfall modellen forberedt fra voksen mus ble utviklet for å utfylle skive i vitro modellen fra juvenile vev. Replikering av funnene i voksen i vivo anfall modellen bidrar til å generalisere resultatene fra skive modeller av adressering iboende bekymringene om ikke-fysiologiske vilkårene for en 2D hjernen SKIVE (versus 3D hele-hjerne struktur) og fysiologiske forskjellene mellom juvenil og voksen vev.
Metoden av behovsbetingede ictal hendelsen er demonstrert med enten puffs av nevrotransmittere med en picospritzer eller optogenetic strategier. Til best av vår kunnskap er vår gruppe først til å starte ictal hendelser i menneskelig vev bruker nevrotransmittere via en picospritzer16. For optogenetic strategier er C57BL/6 mus belastningen konvensjonelle påkjenningen brukes for å uttrykke effekter av transgener. Uttrykk for channelrhodopsin-2 (ChR2) i GABAergic interneurons eller glutamatergic pyramideformet celler vil gi valgfrie muligheten til å generere ictal hendelser på forespørsel med kort lyspulser. Egnet optogenetic mus stammer inkluderer kommersielt tilgjengelig C57BL/6 varianten som uttrykker ChR2 i begge interneurons, bruker musen vesicula GABA transporter promotor (VGAT)24eller pyramideformet celler, bruke musen thymus celle antigen 1 Utbyggeren (Thy1)25. Disse kommersielt tilgjengelige VGAT-ChR2 og Thy1-ChR2 mus tilbyr muligheten til å aktivere GABAergic nerveceller eller glutamatergic neurons, henholdsvis i neocortex med blå (470 nm) lys. Muligheten til å generere ictal hendelser på etterspørselen i akutt anfall modeller kan tilby romanen muligheter til å studere anfall innvielsen dynamics og effektivt vurdere potensielle anti-beslag terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hjernen skiver behandles med et proconvulsant stoff eller en forandret ACSF perfusate å øke nettverks excitability og fremme nedbør ictal hendelser (electrographic anfall-lignende hendelser). Mus, bør foretrukne koronale skiver av somatosensory-motor området inneholde cingulate cortex, område 2 (CG), men ikke retrosplenial området (RS); disse anatomiske markørene å identifisere hvilket koronale skiver som er best for å indusere ictal hendelser. En valgfri modifikasjon for mus vev er å halvert de to halvkulene …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av den kanadiske institutter for helseforskning (MOPP 119603 Peter L. Carlen og Taufik A. Valiante), Ontario hjernen Institute (til Taufik A. Valiante) og Mightex Student Research Grant (til Michael Chang). Vi vil gjerne takke Liam Long for hans hjelp filming video manuskriptet. Vi ønsker å erkjenne Paria Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran og Shadini Dematagoda for deres hjelp i kompilering figurer og tabeller i dette manuskriptet. Tallene 1A, 3A, 4Aog 6A er alle opprinnelige tallene fra data publisert i Chang et al. 16.
Materials
| Sodium pentobarbital | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| 1 mm syringe | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| 25G 5/8” sterile needle | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Single edge razor blade (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Instant adhesive glue | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Lens paper | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Glass petri dish (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Splinter forceps (2x) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| PVC handle micro spatula | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Micro spoon with flat end | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Detailing brush 5/0 | N/A | N/A | Purcahsed from a boutique art store |
| Wide bore transfer pipette | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dental Tweezer | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Thermometer (digital) | N/A | N/A | Purchased on Amazon.ca |
| Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) | N/A | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| Vibratome | Leica | N/A | Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers |
| brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) | Scientific Systems Design Inc | N/A | |
| Sodium Chloride (NaCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium Bicarbonate | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Dextrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Potassium Chloride (KCl) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Calcium Chloride (CaCl2·2H2O) | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
| Sucrose | N/A | N/A | Purchased through UT Med Store |
References
- Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
- Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).
- Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).
- Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
- Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
- Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).
- Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. , 233-246 (2017).
- Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
- Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).
- Engel, J. . Seizures and epilepsy. , (2013).
- Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).
- Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).
- Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
- Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).
- Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).
- Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
- Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).
- Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
- Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
- Heinemann, U., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. , 285-299 (2017).
- Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).
- Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).
- Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
- Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).
- Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).
- DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
- Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).
- Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).
- Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
- Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).
- Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).
- Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).
- Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).
- MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
- Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. , 221-242 (2014).
- Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).
- Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).
