Summary

Analyse van N- glycanen Raphanus sativus Cultivars met behulp van PNGase H+

Published: June 25, 2018
doi:

Summary

Beschrijven we een eenvoudige en snelle methode voor de voorbereiding en analyse van N– glycanen van verschillende cultivars van radijs (Raphanus sativus).

Abstract

In de afgelopen jaren hebben de koolhydraten wordt van planten veel aandacht, ontvangen aangezien zij een potentiële bron van cross-reactive, allergie stemmende immuunrespons. Bovendien, spelen koolhydraten structuren ook een cruciale rol in de stofwisseling van de plant. Hier presenteren we een eenvoudige en snelle methode voor het opstellen en analyseren van N– glycanen van verschillende cultivars van radijs (Raphanus sativus) met behulp van een N– glycanase specifiek voor de vrijlating van plantgerelateerde koolhydraten structuren. Om dit te bereiken, waren ruwe trichloorazijnzuur precipitaten van radijs homogenates behandeld met PNGase H+, en gelabeld met behulp van 2-aminobenzamide als een TL-tag. De gelabelde N– glycan monsters werden vervolgens geanalyseerd door ultra prestatie vloeistofchromatografie (UPLC) scheiding en laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie-time van de vlucht (MALDI-TOF) massaspectrometrie voor een gedetailleerde structurele evaluatie en te kwantificeren van de relatieve abundanties van de radijs-afgeleide N– glycan structuren. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor de analyse van N– glycanen uit verschillende andere plantensoorten en nuttig kan zijn voor de functie nader te onderzoeken en de gevolgen van de N– glycanen op de menselijke gezondheid.

Introduction

N– glycanen in planten hebben meer aandacht getrokken in de afgelopen jaren, zoals het vorige onderzoek heeft N– glycanen onderstreept als een potentiële bron van immunologische kruisreacties die allergische reacties1,2 veroorzaken kunnen . Eerder is aangetoond dat de N– glycanen op plant glycoproteïnen katalytische activiteit3,4, thermostabiliteit en opvouwbare5,6 of subcellular localisatie kan beïnvloeden en secretie7. Om de correlatie tussen de glycan structuren en hun respectieve functies, moet N– glycanen eerst worden vrijgelaten uit glycoproteïnen enzymatisch of chemisch. De klassieke chemische methode voor het vrijgeven van zowel N– en O– glycanen is β-eliminatie, waarin alkalische monster behandeling gaat gepaard met vermindering met natriumboorhydride opbrengst van een alditol8. Echter, deze procedure verzet zich tegen labelen met een fluorophore en veroorzaakt aanzienlijke verval van monosaccharide eenheden vanaf het reducerende einde van de glycan-structuur. Chemische deglycosylation op basis van ammoniak hydroxide/carbonaat behandeling is ook een veelgebruikte alternatieve methode9. Geen van deze methoden van chemische release degradeert intact eiwitten, waardoor massaspectrometrische analyse van labelloze glycan zwembaden zonder tussenkomst van peptide fragmenten in het dezelfde massa bereik. Een nadeel van deze methoden is echter het tempo van de verhoogde afbraak van alpha1, 3-fucosylated- N– glycanen, een gemeenschappelijke structuur van de koolhydraten gevonden in planten10. Als alternatief, enzymatische release methoden met behulp van peptide:N– glycanases (PNGases, EG 3.5.1.52) worden ook op grote schaal toegepast. Recombinant PNGase F (van Flavobacterium meningosepticum) is de meest voorkomende keuze en vergunningen van de vrijlating van alle soorten N– glycanen, behalve de structuren met een core alpha1, 3 fucose11,12. Daarom, PNGase A (geïsoleerd uit amandel zaden) wordt meestal gebruikt voor de analyse van plantaardige N– glycanen13. Echter dit enzym deglycosylates alleen proteolytically afkomstige glycopeptiden, en niet deglycosylate native glycoproteïnen14. Vandaar, een scriptingregel monster workup is vereist voordat verdere analyse, waardoor uitgebreide verlies van glycanen, met name die van lage overvloed15. Het algemene doel van de methode is een geoptimaliseerde workflow voor N– glycan release en fluorescentie labelen op een eenvoudige en robuuste wijze presenteren. De onderliggende reden is dat de PNGase H+, die onlangs werd ontdekt in Terriglobus roseus en recombinantly kunnen worden uitgedrukt in E. coli, N– glycanen rechtstreeks vanaf de steiger van de eiwitten in zure kan hydrolyseren voorwaarden16. Een belangrijk voordeel van het gebruik van PNGase H+ over alternatieve methoden is dat TL labeling reacties in de hetzelfde reactiebuis kunnen worden uitgevoerd zonder de reactie buffers17,18. De eenvoudige bereiding voorwaarden en hoge herstel van lage-overvloed oligosacchariden maken van deze methode een waardevol hulpmiddel bij de analyse van N– glycanen. Dit protocol is geschikt voor de analyse van N– glycanen van verschillende plantensoorten.

Protocol

1. sample collectie Koop verschillende cultivars van verse radijs (Raphanus sativus L.). 2. isolatie van de eiwit van radijs Meng ongeveer 100 g verse radijs met een keuken blender gedurende 10 minuten. De drijfmest overbrengen in een tube van 50 mL centrifuge en centrifuge bij 14.000 × g bij 4 ° C gedurende 20 min te verwijderen van de onoplosbare materiaal. Breng het supernatant zorgvuldig in een nieuwe centrifuge-tube van 50 …

Representative Results

Figuur 1 toont een schematisch overzicht van de beschreven protocol, met inbegrip van de isolatie van proteïnen (glyco-) van radijs, de voorbereiding van N- glycanen, de UPLC-analyse en de MALDI-TOF-MS-analyse van deze onderdelen. Figuur 2 toont representatieve UPLC chromatogrammen van derivatized N- glycanen van de geanalyseerde radijs cultivars. Figuur 3 toont de verkregen result…

Discussion

Het protocol dat wij hier hebben ingediend kan de vergelijking van de N– glycan profielen van verschillende cultivars van radijs. Een belangrijk voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande protocollen is dat geen wijzigingen van de buffer tussen de enzymatische vrijlating van N– glycanen en de reactie van de bewerking met 2-AB vereist zijn. De meest kritische stap van deze procedure is de zuivering van N– glycanen met behulp van de kolom van de SPE, als het niet verwijderen van zouten …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Natural Science Foundation van China (verlenen nummers 31471703, A0201300537 en 31671854 J.V. en L.L., verlenen G.Y. nummer 31470435), en de 100 buitenlandse talenten Plan (subsidie getal JSB2014012 J.V.).

Materials

Chemicals:
Trichloroacetic acid  SCR, Shanghai 80132618
Acetic acid glacial Huada, Guangzhou 64-19-7
Acetonitrile General-reagent G80988C
Trifluoroacetic acid Energy chemical W810031
2-aminobenzamide Heowns, Tianjin A41900
Sodium cyanoborohydride J&K Scientific Ltd 314162
Dimethyl sulfoxide Huada, Guangzhou 67-68-5
2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol Agilent Technologies AT-5190-6998
6-Aza-2-thiothymine  Sigma 275514
Tools/Materials:
Kitchen blender Bear, Guangzhou LLJ-A10T1
Centrifuge Techcomp CT15RT
Centrifugal Evaporator Hualida, Taicang LNG-T120
SPE column Supelco Supelclean ENVI Carb SPE column
MALDI-TOF mass spectrometer Bruker Autoflex
HPLC Analysis:
High-recovery HPLC vial Agilent Technologies  # 5188-2788
HPLC System Shimadzu Nexera
Fluorescence Detector for HPLC Shimadzu RF-20Axs 
Column oven Hengxin CO-2000
HPLC Column Waters Acquity UPLC BEH glycan column 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size
LCMS-grade Water Merck Millipore #WX00011
LCMS-grade Acetonitrile Merck Millipore # 100029
Formic acid Aladdin F112034
Ammonia solution Aladdin A112080

References

  1. Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
  2. Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).
  3. Biswas, H., Chattopadhyaya, R. Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation. Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).
  4. Lefebvre, B., et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).
  5. Severino, V., et al. The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves. Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).
  6. Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).
  7. Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins. Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).
  8. Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates. Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).
  9. Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis. Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).
  10. Triguero, A., et al. Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants. Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).
  11. Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
  12. Fan, J. -. Q., Lee, Y. C. Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).
  13. Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans. European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).
  14. Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
  15. Wang, T., Voglmeir, J. PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis. Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).
  16. Wang, T., et al. Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A. Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).
  17. Du, Y. M., et al. Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).
  18. Wang, T., Hu, X. -. C., Cai, Z. -. P., Voglmeir, J., Liu, L. Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).
  19. Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).
check_url/57979?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Du, Y., Zheng, S., Liu, L., Voglmeir, J., Yedid, G. Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+. J. Vis. Exp. (136), e57979, doi:10.3791/57979 (2018).

View Video