Beschrijven we een eenvoudige en snelle methode voor de voorbereiding en analyse van N– glycanen van verschillende cultivars van radijs (Raphanus sativus).
In de afgelopen jaren hebben de koolhydraten wordt van planten veel aandacht, ontvangen aangezien zij een potentiële bron van cross-reactive, allergie stemmende immuunrespons. Bovendien, spelen koolhydraten structuren ook een cruciale rol in de stofwisseling van de plant. Hier presenteren we een eenvoudige en snelle methode voor het opstellen en analyseren van N– glycanen van verschillende cultivars van radijs (Raphanus sativus) met behulp van een N– glycanase specifiek voor de vrijlating van plantgerelateerde koolhydraten structuren. Om dit te bereiken, waren ruwe trichloorazijnzuur precipitaten van radijs homogenates behandeld met PNGase H+, en gelabeld met behulp van 2-aminobenzamide als een TL-tag. De gelabelde N– glycan monsters werden vervolgens geanalyseerd door ultra prestatie vloeistofchromatografie (UPLC) scheiding en laser matrix-bijgewoonde desorptie ionisatie-time van de vlucht (MALDI-TOF) massaspectrometrie voor een gedetailleerde structurele evaluatie en te kwantificeren van de relatieve abundanties van de radijs-afgeleide N– glycan structuren. Dit protocol kan ook worden gebruikt voor de analyse van N– glycanen uit verschillende andere plantensoorten en nuttig kan zijn voor de functie nader te onderzoeken en de gevolgen van de N– glycanen op de menselijke gezondheid.
N– glycanen in planten hebben meer aandacht getrokken in de afgelopen jaren, zoals het vorige onderzoek heeft N– glycanen onderstreept als een potentiële bron van immunologische kruisreacties die allergische reacties1,2 veroorzaken kunnen . Eerder is aangetoond dat de N– glycanen op plant glycoproteïnen katalytische activiteit3,4, thermostabiliteit en opvouwbare5,6 of subcellular localisatie kan beïnvloeden en secretie7. Om de correlatie tussen de glycan structuren en hun respectieve functies, moet N– glycanen eerst worden vrijgelaten uit glycoproteïnen enzymatisch of chemisch. De klassieke chemische methode voor het vrijgeven van zowel N– en O– glycanen is β-eliminatie, waarin alkalische monster behandeling gaat gepaard met vermindering met natriumboorhydride opbrengst van een alditol8. Echter, deze procedure verzet zich tegen labelen met een fluorophore en veroorzaakt aanzienlijke verval van monosaccharide eenheden vanaf het reducerende einde van de glycan-structuur. Chemische deglycosylation op basis van ammoniak hydroxide/carbonaat behandeling is ook een veelgebruikte alternatieve methode9. Geen van deze methoden van chemische release degradeert intact eiwitten, waardoor massaspectrometrische analyse van labelloze glycan zwembaden zonder tussenkomst van peptide fragmenten in het dezelfde massa bereik. Een nadeel van deze methoden is echter het tempo van de verhoogde afbraak van alpha1, 3-fucosylated- N– glycanen, een gemeenschappelijke structuur van de koolhydraten gevonden in planten10. Als alternatief, enzymatische release methoden met behulp van peptide:N– glycanases (PNGases, EG 3.5.1.52) worden ook op grote schaal toegepast. Recombinant PNGase F (van Flavobacterium meningosepticum) is de meest voorkomende keuze en vergunningen van de vrijlating van alle soorten N– glycanen, behalve de structuren met een core alpha1, 3 fucose11,12. Daarom, PNGase A (geïsoleerd uit amandel zaden) wordt meestal gebruikt voor de analyse van plantaardige N– glycanen13. Echter dit enzym deglycosylates alleen proteolytically afkomstige glycopeptiden, en niet deglycosylate native glycoproteïnen14. Vandaar, een scriptingregel monster workup is vereist voordat verdere analyse, waardoor uitgebreide verlies van glycanen, met name die van lage overvloed15. Het algemene doel van de methode is een geoptimaliseerde workflow voor N– glycan release en fluorescentie labelen op een eenvoudige en robuuste wijze presenteren. De onderliggende reden is dat de PNGase H+, die onlangs werd ontdekt in Terriglobus roseus en recombinantly kunnen worden uitgedrukt in E. coli, N– glycanen rechtstreeks vanaf de steiger van de eiwitten in zure kan hydrolyseren voorwaarden16. Een belangrijk voordeel van het gebruik van PNGase H+ over alternatieve methoden is dat TL labeling reacties in de hetzelfde reactiebuis kunnen worden uitgevoerd zonder de reactie buffers17,18. De eenvoudige bereiding voorwaarden en hoge herstel van lage-overvloed oligosacchariden maken van deze methode een waardevol hulpmiddel bij de analyse van N– glycanen. Dit protocol is geschikt voor de analyse van N– glycanen van verschillende plantensoorten.
Het protocol dat wij hier hebben ingediend kan de vergelijking van de N– glycan profielen van verschillende cultivars van radijs. Een belangrijk voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande protocollen is dat geen wijzigingen van de buffer tussen de enzymatische vrijlating van N– glycanen en de reactie van de bewerking met 2-AB vereist zijn. De meest kritische stap van deze procedure is de zuivering van N– glycanen met behulp van de kolom van de SPE, als het niet verwijderen van zouten …
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Natural Science Foundation van China (verlenen nummers 31471703, A0201300537 en 31671854 J.V. en L.L., verlenen G.Y. nummer 31470435), en de 100 buitenlandse talenten Plan (subsidie getal JSB2014012 J.V.).
Chemicals: | |||
Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
Tools/Materials: | |||
Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
HPLC Analysis: | |||
High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
Formic acid | Aladdin | F112034 | |
Ammonia solution | Aladdin | A112080 |