Summary
يصف لنا طريقة بسيطة وسريعة لإعداد وتحليل نون-جليكانس من أصناف مختلفة من الفجل (الزعفران فجل).
Abstract
في السنوات الأخيرة، مويتيس الكربوهيدرات من النباتات قد حظي باهتمام كبير، كما مصدر محتمل للاستجابات المناعية تحسن، والمثيرة للحساسية. وباﻹضافة إلى ذلك، هياكل الكربوهيدرات أيضا أن تلعب دوراً حاسما في الأيض النباتية. وهنا، يقدم طريقة بسيطة وسريعة لإعداد وتحليل نون-جليكانس من أصناف مختلفة من الفجل (فجل الزعفران) باستخدام N-جليكاناسي محددة للإفراج عن هياكل الكربوهيدرات المشتقة من النباتات. ولتحقيق ذلك، رواسب الخام التريكلوروسيتيك حامض من الفجل هوموجيناتيس تعامل مع بنغازي ح+، والمسمى باستخدام 2-أمينوبينزاميدي كعلامة نيون. حللت العينات-جليكان نالمسمى فيما بعد بالليزر ساعد مصفوفة الامتزاز التأين وقت للطيران (استخدام-TOF) الطيف الكتلي لهيكلي مفصلة وفائقة الأداء اللوني السائل (أوبلك) فصل تقييم وتقدير أبوندانسيس النسبية لهياكل المستمدة من الفجل-جليكان ن. هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل N-جليكانس من مختلف الأنواع النباتية الأخرى، وقد يكون من المفيد إجراء مزيد من التحقيقات للدالة وآثار N-جليكانس على صحة الإنسان.
Introduction
N-جليكانس في النباتات قد لفتت الانتباه المتزايد في السنوات الأخيرة، كما أبرزت البحوث السابقة N-جليكانس كمصدر محتمل كروسريكشنز المناعية التي قد تثير حساسية ردود1،2 . وقد ثبت سابقا أن N-جليكانس على جليكوبروتينس النباتية يمكن أن تؤثر على نشاط الحفاز3،4، ثبات وقابلة للطي5،6 أو التعريب سوبسيلولار و 7من إفراز. من أجل ربط هياكل جليكان مع المهام المنوطة بها، N-جليكانس يجب أولاً الإفراج عن من جليكوبروتينس أما كيميائيا أو انزيماتيكالي. هو الأسلوب الكيميائية الكلاسيكية للإفراج عن كل من N-و يا-جليكانس β-القضاء، الذي يرافق العلاج عينة القلوية الحد مع بورهيدريد تؤتي الديتول8. ومع ذلك، هذا الإجراء يحول دون وضع العلامات مع فلوروفوري وتسبب تسوس كبيرة من وحدات أحادي من نهاية الحد من هيكل جليكان. ديجليكوسيليشن الكيميائية استناداً إلى معاملة هيدروكسيد الأمونيوم/كربونات هو أيضا طريقة بديلة المستخدمة عادة9. أيا من هذه الأساليب الإفراج عن المواد الكيميائية يحط البروتينات سليمة، مما يسمح التحليل الشامل والمطيافيه برك جليكان غير مسمى دون تدخل الشظايا الببتيد في نفس النطاق الشامل. ومع ذلك، هو عيب واحد من هذه الأساليب معدل التدهور المتزايد α1, N3-فوكوسيلاتيد-جليكانس، العثور على هيكل مشترك الكربوهيدرات في النباتات10. وبدلاً من ذلك، الإصدار الانزيمية أساليب استخدام الببتيد:N-جليكاناسيس (بنجاسيس، المفوضية الأوروبية 3.5.1.52) تطبق أيضا على نطاق واسع. المؤتلف و بنغازي (من فلافوباكتيريوم meningosepticum) هو الخيار الأكثر شيوعاً ويسمح بالإفراج عن جميع أنواع N-جليكانس، عدا الهياكل التي تحمل α1 الأساسية، فوكس 311،12. ولذلك يستخدم عادة ببنغازي (معزولة من بذور اللوز) لتحليل النبات N-جليكانس13. غير أن هذا الإنزيم ديجليكوسيلاتيس فقط بروتيوليتيكالي المستمدة من جليكوبيبتيديس، وهو غير قادر على ديجليكوسيلاتي جليكوبروتينس الأصلية14. ومن ثم، مطلوب من workup نموذج متعدد خطوة قبل مزيد من التحليل، الذي يتسبب في خسائر كبيرة في جليكانس، لا سيما تلك التي وفرة منخفضة15. والهدف العام للأسلوب تقديم سير العمل أمثل للإصدار-جليكان نوالأسفار التي وصفها بطريقة بسيطة وقوية. الأساس المنطقي هو أن ح بنغازي+، الذي تم اكتشافه مؤخرا في roseus تيريجلوبوس ويمكن التعبير عن ريكومبينانتلي في كولاي، يمكن أن يتحلل N-جليكانس مباشرة من السقالة البروتين في الحمضية 16من الشروط. مزايا رئيسية لاستخدام أكثر الأساليب البديلة من بنغازي ح+ أن ردود الفعل وضع العلامات الفلورية يمكن أن يؤديها في أنبوب رد الفعل نفسه دون تغيير في رد فعل المخازن المؤقتة17،18. شروط إعداد بسيطة والانتعاش عالية من oligosaccharides وفرة منخفضة تجعل هذا الأسلوب أداة قيمة في تحليل N-جليكانس. هذا البروتوكول مناسبة لتحليل N-جليكانس من مختلف الأنواع النباتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جمع العينات
- شراء أصناف مختلفة من الفجل الطازج (الزعفران فجل L.).
2-عزل البروتين من فجل
- مجانسة حوالي 100 جرام فجل الطازج مع خلاط مطبخ لمدة 10 دقائق.
- نقل الملاط إلى 50 مل أنبوبة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في × 14,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة إزالة المواد غير قابلة للذوبان.
- نقل المادة طافية بعناية في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي جديدة وإضافة وحدة تخزين متساوية من حل حمض التريكلوروسيتيك (TCA) م 2.
ملاحظة: إضافة كلورفورم الميثيل سوف يعجل بالبروتينات القابلة للذوبان (جليكو). - الطرد المركزي في × 14,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وإزالة المادة طافية من البروتينات الأعلاف (جليكو).
- أغسل بيليه مع 20 مل من المياه وأجهزة الطرد المركزي في × 14,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإزالة oligosaccharides القابلة للذوبان والسكريات.
- كرر الخطوة 2، 5. أربع مرات.
- إعادة تعليق الكريات في 1 مل من المياه ونقلها إلى أنبوب الطرد مركزي طازجة 1.5 مل.
3-إعداد N-جليكانس
- ميكس 50 ميليلتر من حل البروتين من الخطوة 2.7. (ما يعادل 5 غ فجل الطازجة) مع مو 0.2 من بنغازي المؤتلف ح+ في حمض الخليك 10 ملم.
- احتضان الخليط رد الفعل عند 37 درجة مئوية ح 12. وبعد التفريخ، الطرد المركزي في × 14,000 ز لمدة 5 دقائق لإزالة الزائدة من البروتين والانزيم.
- نقل المادة طافية إلى أنبوب الطرد مركزي طازجة 1.5 مل.
4-تنقية N-جليكانس
- إعداد العمود الاستخراج المرحلة الصلبة (SPE) لإثراء N-جليكانس وإزالة الأملاح، وغيرها من الشوائب من خليط رد الفعل، زيادة القدرة الانتقائية لعامل وضع العلامات (2-AB) 2-أمينوبينزاميدي فلوروجينيك N-جليكان derivatization.
- أضف 3 مل مياه لغسل العمود.
- أضف 3 مل محلول الاسيتو الانيتريل 80% يحتوي على حامض trifluoroacetic (تفا، 0.1% v/v) إلى نشط جمعية مهندسي البترول العمود.
- أضف 3 مل مياه حجته العمود جمعية مهندسي البترول.
- نقل العينة من الخطوة 3، 3 على العمود وتجاهل في التدفق من خلال.
- إضافة 1.5 مل مياه ليغسل العمود وتجاهل في التدفق من خلال.
- الوت N-جليكانس المفرج عنهم من العمود باستخدام 1.5 مل محلول 20% الاسيتو الانيتريل مائي، يحتوي على 0.1% تفا (v/v) في أنبوب الطرد مركزي 2 مل.
- إزالة المذيب بالطرد المركزي التبخر في درجة حرارة الغرفة. تتبخر حتى تكون العينة جافة تماما.
5-الأسفار Derivatization من N-جليكانس
- إعداد 1 مل من محلول 2-AB، تتألف من 35 مم 2-آب وم 0.1 سيانوبوروهيدريدي الصوديوم في حل ثنائي ميثيل حمض الخليك/سلفوكسيد (7:3، v/v).
- إضافة 5 ميليلتر 2-آب حل للعينات المجففة (الخطوة 4.5.) المستمدة من ستة الفجل مختلفة. دوامة حل كل عينة حتى تماما.
- احتضان هذا الخليط ح 2 في 65 درجة مئوية.
- السماح لتبرد عينة وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، وإضافة 5 ميليلتر من المياه و 40 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 14,000 س ز لمدة 3 دقائق.
- نقل 48 ميليلتر من المادة طافية في قنينة ميليلتر انتعاش عالية 300 [هبلك]. تخزين العينات-جليكان نديريفاتيزيد في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
6-هيليك-UPLC التنميط من N-جليكانس
- تحليل العينات باستخدام نظام أوبلك قياسية متصلة ديتيكتورسيت fluorescence عبر إنترنت عند أطوال موجية الإثارة/الانبعاثات من 330 نيوتن متر/420 نانومتر، على التوالي.
- استخدام لوني سائل في تفاعل مسعور (هيليك)-أوبلك جليكان عمود عند درجة حرارة 60 درجة مئوية للتحليل عمود.
- إعداد بالمذيبات بتمييع 50 مل من محلول الأسهم (الحل فورمات الأمونيوم 1 متر، والرقم الهيدروجيني 4.5) مع 950 مل من سائل الفصل اللوني-الكتلي (LCMS)-الصف المياه. إعداد الحل الأسهم على النحو التالي:
- إضافة 43 مل حمض الفورميك إلى 700 مل ح لكمس-الصف2o.
- قم بضبط درجة الحموضة إلى 4.5 بإضافة دروبويسي من محلول مائي الأمونيا (25% w/w).
- نقل المذيب لإسطوانة قياس وملء يصل إلى 1000 مل مع الصف لكمس ح2"سين مخزن" في 4-6 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
- استخدام الصف لكمس الاسيتو الانيتريل كباء المذيبات
- فصل N-جليكانس مع شطف التدرج التالي:
- ابدأ بإضافة 95% ب المذيبات في المذيبات ألف مجموعة معدل التدفق في 0.5 مل/دقيقة من 0 إلى 44.5 دقيقة.
- تدريجيا من 0 دقيقة بدقيقة 6، يخفض نسبة المذيب ب مع ٪ to78 تدرج خطي.
- تدريجيا من 6 دقيقة بدقيقة 44.5، يخفض نسبة المذيب ب مع تدرج خطي إلى 55.9 في المائة.
- من 44.5 دقيقة بدقيقة 46.5، سرعة انخفاض نسبة المذيب ب مع تدرج خطي من 55.9 في المائة إلى 0% واضغط على 0% لمدة 2 دقيقة، والشروع في غسل العمود. خفض معدل التدفق إلى 0.25 مل/دقيقة من 44.5 إلى 55 دقيقة.
- أغسل العمود كذلك بزيادة ب المذيبات إلى 95% من 48.5 دقيقة بدقيقة 50.5 بنسبة 95% لدقيقة 4.5.
- إعادة توازن العمود إلى شروط الانطلاق من المذيبات 95% ب في 0.5 مل/دقيقة من 50.5 إلى 57 دقيقة.
- حقن ميليلتر 45 من العينة في النظام أوبلك.
- الوت N-جليكانس التي أوبلك مع الاحتفاظ بأوقات بين 15 و 40 دقيقة.
- جمع كل جزء ذروة UPLC لوحظ استخدام أنابيب الطرد المركزي 2 مل وتجفيف العينات بالتبخر الطرد المركزي.
- حقن حوالي 1 بمول من 2-آب المسمى ديكستران القياسية (2−20 الجلوكوز وحدات) لمعايرة المصنع-N-جليكان التنميط، وتعيين أوقات شطف الخاصة بهم إلى وحدات الجلوكوز موحدة.
7-استخدام-TOF الكتلي
- حل العينات المأخوذة من الخطوة 6.8 في 5 ميليلتر من لكمس-الصف المياه. ميكس 1 ميليلتر الحل عينة وميليلتر 1 6-عزة-2-ثيوثيميني (توري) الحل (0.3% w/v في الاسيتو الانيتريل المائية 70% v/v)، وماصة المخلوط على الناقل TOF استخدام عينة.
- تحليل العينات استخدام أداة مطياف كتلة TOF استخدام في وضع أيون إيجابية عن طريق الضغط على زر ابدأ .
- تحليل الأطياف الشامل باستخدام برنامج تحليل استخدام-TOF-MS المصاحبة لها.
- تفسير الأطياف باستخدام مصادر مفتوحة جليكان تفسير برامج19. تعيين معلمات البحث 2-آب وسم، [M + Na]+، وتعيين المعلمة دقة 2.0 دا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 1 نظرة تخطيطية لوصف البروتوكول، بما في ذلك عزل البروتينات (جليكو-) من فجل وإعداد N-جليكانس، وتحليل أوبلك وتحليل استخدام-TOF-مرض التصلب العصبي المتعدد لهذه المكونات. ويبين الشكل 2 الممثل تشروماتوجرامس أوبلك من ديريفاتيزيد ن-جليكانس من أصناف فجل تحليل. ويبين الشكل 3 النتائج التي تم الحصول عليها من الهياكل-جليكان نديريفاتيزيد 2AB استخدام استخدام TOF الكتلي. ويبين الشكل 4 تكوين كمية من N-جليكانس من كل الأصناف المستنبطة فجل.
الشكل 1 : نظرة عامة التخطيطي لأسلوب تحليل وصف N-جليكانس الإفراج عن glycoproteins الفجل- ويشمل الأسلوب الإعداد (جليكو-) البروتينات و نون-جليكانس والتنميط UPLC وتحليل استخدام-TOF-مرض التصلب العصبي المتعدد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : N ملامح--جليكان 2-آب المسمى N -جليكانس- ن-جليكانس يتم عزل من الفجل الأحمر والفجل الأخضر، الفجل جيجيول، daikon، فجل الكرز وفجل البطيخ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تحليل والمطيافيه الجماعي N -جليكان عينات تم عزلة بواسطة هيليك-أوبلك- ن-جليكانس في كل الطيفية التي تجمعها في ذروة نفسه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تكوين كمية من N -جليكانس من كل الأصناف المستنبطة فجل. تمثل أحجام الدوائر والهلال الوفرة النسبية للمسمى 2AB N-جليكانس من جليكوبروتينس الفجل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يسمح البروتوكول وقد قدمنا هنا المقارنة بين الملامح-جليكان نمن أصناف شتى من الفجل. ميزة كبيرة لهذا الأسلوب مقارنة بالبروتوكولات القائمة أنه لا توجد تغييرات العازلة بين إطلاق سراح الانزيمية N-جليكانس ورد derivatization مع 2-آب مطلوبة. أن الخطوة الأكثر أهمية لهذا الإجراء هو تنقية N-جليكانس باستخدام العمود جمعية مهندسي البترول، كعدم إزالة الأملاح أو غيرها من الشوائب في خليط رد فعل قد تؤثر سلبا على كفاءة derivatization الأسفار. الأسلوب كما عرضت هنا فقط يسمح بتقييم وفرة نسبية من مختلف N-جليكانس؛ يتطلب التحديد الكمي المطلق إضافة معيار الداخلية (مثل مالتوبينتوسي) في الخطوة 2، 1.
بدلاً من ذلك، يمكن بسهولة تعديل عامل derivatization المستخدمة هنا (2-AB) باستخدام 2-أمينوبيريديني (2-AP) أو غيرها من العناصر derivatization. يمكن أيضا فصل مشتقات N-جليكان التي تم الحصول عليها من الخطوة 5، 3 بحجم الاستبعاد اللوني (ثانية)، قوية أو ضعيفة شاردة تبادل اللوني (ساكس أو الشمع)، أو أساليب [هبلك] عكس المرحلة (على الرغم من المحتمل مع القرار أدنى). كذلك التحقق من هياكل N-جليكانس، يمكن استخدام العلاجات اكسوجليكوسيداسي متسلسلة بعد الخطوة 5.3 لوصف هيكل N-جليكانس مع مزيد من التفاصيل. وأخيراً، يمكن أن يتم تحليل العينات المأخوذة من الخطوة 6.8 المزيد باستخدام استخدام TOF-مللي ثانيةn-على أساس أساليب التجزئة. وتشمل التطبيقات المستقبلية الممكنة لدينا بروتوكول التحقيق في الآثار الدالة والصحة من N-جليكانس من الفجل أو غيرها من الأنواع النباتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أيد هذا العمل جزئيا "مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية" (منح أرقام 31471703، A0201300537، و 31671854 إلى J.V. ول، منح عدد 31470435 G.Y.)، وهذه الخطة المواهب الأجنبية 100 (رقم المنحة JSB2014012 إلى J.V.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals: | |||
| Trichloroacetic acid | SCR, Shanghai | 80132618 | |
| Acetic acid glacial | Huada, Guangzhou | 64-19-7 | |
| Acetonitrile | General-reagent | G80988C | |
| Trifluoroacetic acid | Energy chemical | W810031 | |
| 2-aminobenzamide | Heowns, Tianjin | A41900 | |
| Sodium cyanoborohydride | J&K Scientific Ltd | 314162 | |
| Dimethyl sulfoxide | Huada, Guangzhou | 67-68-5 | |
| 2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol | Agilent Technologies | AT-5190-6998 | |
| 6-Aza-2-thiothymine | Sigma | 275514 | |
| Tools/Materials: | |||
| Kitchen blender | Bear, Guangzhou | LLJ-A10T1 | |
| Centrifuge | Techcomp | CT15RT | |
| Centrifugal Evaporator | Hualida, Taicang | LNG-T120 | |
| SPE column | Supelco | Supelclean ENVI Carb SPE column | |
| MALDI-TOF mass spectrometer | Bruker | Autoflex | |
| HPLC Analysis: | |||
| High-recovery HPLC vial | Agilent Technologies | # 5188-2788 | |
| HPLC System | Shimadzu | Nexera | |
| Fluorescence Detector for HPLC | Shimadzu | RF-20Axs | |
| Column oven | Hengxin | CO-2000 | |
| HPLC Column | Waters | Acquity UPLC BEH glycan column | 2.1 × 150 mm, 1.7 μm particle size |
| LCMS-grade Water | Merck Millipore | #WX00011 | |
| LCMS-grade Acetonitrile | Merck Millipore | # 100029 | |
| Formic acid | Aladdin | F112034 | |
| Ammonia solution | Aladdin | A112080 |
References
- Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
- Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).
- Biswas, H., Chattopadhyaya, R. Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation. Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).
- Lefebvre, B., et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).
- Severino, V., et al. The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves. Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).
- Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).
- Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins. Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).
- Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates. Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).
- Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis. Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).
- Triguero, A., et al. Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants. Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).
- Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
- Fan, J. -Q., Lee, Y. C. Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).
- Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans. European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).
- Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
- Wang, T., Voglmeir, J. PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis. Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).
- Wang, T., et al. Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A. Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).
- Du, Y. M., et al. Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).
- Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).
- Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).
